Aplicaciones de la Biotecnologia

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APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA EN EL ESTUDIO Y CONSERVACIÓN DE LA GUADUA EN COLOMBIA Grupo de investigación en biodiversidad y biotecnología Universidad Tecnológica de Pereira E- mail: [email protected]

Taxonomía de la Guadua angustifolia Kunth • Es una especie botánica de la subfamilia de las gramíneas Bambusoideae. • Rizomatosa, perenne, algo trepadora, erecta en la base. • Láminas foliares linear-lanceoladas, desiguales en tamaño.

Filogenia de la especie en la familia Poaceae

Filogenia de la especie en la subtribu Chusqueinae

Aplicaciones de la biotecnología Se dividen en dos grandes grupos: A. Cultivo In vitro de células tejidos vegetales • Regeneración exitosa de vegetales después de su cultivo In vitro • Producción de híbridos somáticos • Producción de plantas transgénicas • Obtención de variantes somaclonales

B. Actualización de la metodología genética y caracterización de recursos fitogenéticos • Desarrollo de mapas genéticos • Marcado o etiquetado de genes • Selección asistida por marcadores (MAS) • Caracterización de colecciones e identificación de duplicados en las mismas. • Delimitación de centros de origen

Programa 1. La célula vegetal 2. Introducción a la genética vegetal 2.1. Conceptos 2.2. El experimento de Mendel 2.3. Excepciones a las leyes de Mendel 3. Aplicaciones de la biotecnología vegetal 3.1. Marcadores genéticos y moleculares 3.2. AFLP 3.3. Microsatélites (SSR) 4. Estimación de la variabilidad genética y morfológica en accesiones de Guadua spp en Colombia

Célula Vegetal

Partes de un cromosoma

LOCUS: Lugar físico de un gen dado en un cromosoma. Su plural es LOCI

Meter figura

La secuencia de nucleótidos en el locus de un gen dado es siempre parecida en cromosomas homólogos. Secuencias de nucleótidos diferentes en el mismo locus del gen en dos cromosomas homólogos producen formas alternativas del gen, llamados ALELOS

Si dos cromosomas homólogos en un organismo tienen los mismos alelos, este es HOMOCIGOTO (AA ó aa) Si dos cromosomas homólogos tienen alelos diferentes en un locus dado es HETEROCIGOTO (Aa)

El experimento de Mendel: • Seleccionó una planta de autopolinización • Manualmente se puede polinizar de forma cruzada • Trabajó solo con una característica a la vez

Mendel formuló una hipótesis de cinco aspectos para explicar sus resultados: • Cada característica es determinada por GENES. Cada organismo tiene dos genes, que juntos controlan la expresión de una característica determinada. • Pares de genes se separan durante la formación de gametos. Cada gameto recibe solo uno de un par de genes del organismo.

• Cuando el gen de un par de genes queda incluido en un gameto es determinado por el azar. La separación de pares de cromosomas homólogos durante la meiosis se realiza de manera fortuita

• Cuando están presentes dos formas alternas de un gen (Dominante), puede enmascarar la expresión del otro (Recesivo).

• Un organismo homocigoto para cierta característica solo podrá producir un tipo de gameto. Un organismo heterocigoto produce dos gametos con cada uno de los alelos. Un padre púrpura PP produce gametos P Un padre púrpura Pp produce gametos P y p Un padre blanco pp produce gametos p

En el experimento de Mendel en la generación F2 se produjeron tres tipos de descendencia: 1/4PP, 1/2Pp y 1/4pp

• HERENCIA POLIGENICA: Dos o mas genes pueden producir contribuciones funcionalmente equivalentes a la característica. Ej. En el trigo hay dos pares de genes para el color del grano. • EPISTASIS: La expresión de un gen depende de, o es modificada por, la expresión de otro gen. • PLEIOTROPIA: Un solo gen puede tener varios efectos fenotípicos. Ej: Albinismo en ratón

Marcadores moleculares MARCADOR GENETICO

Cualquier diferencia fenotípica controlada genéticamente utilizada en el análisis genético (Rieger et al, 1982). Cualquier medio para identificar cualquier locus específico en un cromosoma (Gale, 1994)

Ventajas de los marcadores moleculares • Muestran mayores niveles de variabilidad • La mayor variabilidad es neutra • Permiten estudiar tres genomas distintos (nuclear, mitocondrial y de cloroplasto) • Los polimorfismos a nivel de ADN se ven menos afectados por modificaciones postranscripcionales y postrasduccionales • No son influenciados por el medio ambiente. • Aceleran procesos de fitomejoramiento

Enzimas de digestión

Marcadores basados en la Reacción en cadena de la polimerasa

Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP) • Desarrollado por Vos Pieter et al (1995). Marca registrada de Invitrogen • Es una técnica que combina la restricción de la digestión y la PCR. • Es muy reproducible • Es costoso y requiere grandes cantidades de ADN.

Esquema

Aplicaciones

Microsatélites (Simple sequence repeats - SSR) • • • • • •

Codominantes Muy reproducibles Costo – eficientes Demandan el diseño previo de primers Muy polimórficos Útiles en caracterización de variedades

POLIMORFISMOS CON MICROSATELITES 1. ACTACGCATATATATATATATATATATATATGGATCCA

(TA)11

2. ACTACGCATATATATATATATATATATATGGATCCA (TA)10

3. ACTACGCATATATATATATATATATATATATATGGATCCA 4. ACTACGCATATATATATATATATATATGGATCCA Control

( TA)12

(TA)9 1

2

3

4

800

PAGE

500 200 100

50 CIAT - BRU

Marcadores microsatélites GENOTYPE 1 ( CT )

GENOTYPE 2 ( CT )

25

18

PCR Control 800

PAGE

1

2

500 200 100 50 CIAT - BRU

Caracterización de un insecto – plaga que atacaba varios cultivos

¿Cómo seleccionar el marcador adecuado?

Selección asistida por marcadores (MAS)

Estimación de la variabilidad genética y morfológica en accesiones de Guadua spp. en Colombia

Marulanda, M.L.,López, A.M., Claroz, J.L. Grupo de Investigación en Biodiversidad y Biotecnología Facultad de Ciencias Ambientales Universidad Tecnológica de Pereira

Como apoyo a la selección y al mejoramiento genético se han desarrollado los marcadores moleculares o huellas digitales de ADN.

Esta tecnología se utiliza para la identificación de genotipos, para medir distancias genéticas entre individuos muy relacionados entre sí y para conocer la variabilidad existente en una colecta de germoplasma.

Para estudios de variabilidad genética en poblaciones naturales.

La variabilidad fenotípica: calidad de los tallos, coloración, presencia de rayas, son variaciones que pueden ser detectadas a nivel de ADN, con los marcadores moleculares.

El estudio con marcadores moleculares aporta información valiosa acerca de la variabilidad del género Guadua en Colombia y se convierte en una herramienta para la toma de decisiones sobre el uso y conservación de la especie.

PROYECCIONES AL FUTURO • Relacionar los marcadores moleculares con marcadores morfológicos de interés. • Poseer una herramienta para facilitar los procesos de selección de biotipos de interés comercial.

Familia Poaceae Subfamilia Bambusoideae • Los bambúes incluyen 90 géneros en regiones tropicales y subtropicales de Asia y América (Clark,1995) • Se conocen 20 géneros de bambúes leñosos Neotropicales distribuidos desde México hasta Chile (Soderstrom et al, 1998) • Las áreas de mayor diversidad y endemismo son Brasil, Norte y Centro de Los Andes, y México (Clark, 1990 b)

Géneros de bambúes leñosos Andinos • Arthrostylidium, Aulonemia, Chusquea, Elytrostachys, Guadua, Neurolepis, Y Rhipidocladum (Clark, 1995). • Su área de distribución incluye Venezuela, Colombia y Perú.

• Ninguno de los géneros es exclusivo de Los Andes, pero aprox. el 90 % de las especies son endémicas( Gentry, 1982).

Género Guadua • Se distribuye desde México hasta Sur América (Londoño,1990). • Está constituido por aprox. 33 especies, la mayoría ocurren en zonas bajas: la cuenca Amazónica, los bosques de la zona atlántica, bosques de galería y el cerrado. • Brasil es el principal centro de diversidad. • Guadua angustifolia Kunth y Guadua weberbaueri Londoño & Peterson, son las especies Andinas (Clark, 1995)

Distribución potencial de Guadua angustifolia

Fuente: Bystriakova et al (2003).

OBJETIVOS • Analizar las distancias genéticas entre las especies del género Guadua. • Analizar la distancia genética entre la G. angustifolia Kunth. y las variedades y biotipos . • Determinar la variabilidad de la especie en el eje cafetero. • Relacionar características morfológicas y moleculares en accesiones de Guadua spp. Colectadas en toda Colombia

MATERIALES Y MÉTODOS • Se seleccionaron 55 accesiones de especies y variedades de Guadua spp; 37  Jardín Botánico Juan María Céspedes, del Instituto Vallecaucano de Investigaciones científicas INCIVA en Mateguadua, Tulúa, Valle. 18  Zona cafetera

G. angustifolia cotuda

G. angustifolia nigra

BIOTIPOS DE Guadua angustifolia

BIOTIPO CEBOLLA: Morelia (Risaralda) 1.216 msnm.

BIOTIPO COTUDA: Hacienda Nápoles, Montenegro (Quindío) 1.228 msnm.

BIOTIPOS DE Guadua angustifolia

BIOTIPO MACANA: Piedras de moler. Cartago (Valle) 1.208 msnm.

BIOTIPO CASTILLA: Hacienda Nápoles. Montenegro (Quindío) 1.228 msnm.

VARIEDADES DE Guadua angustifolia

Guadua angustifolia var Nigra, Valle de Cocora, Salento (Quindío) 1.928 msnm.

Guadua angustifolia var Bicolor, Belalcazar (Caldas) 2.140 msnm.

MARCADORES MOLECULARES ◆ AFLPs: polimorfismo de fragmentos restricción amplificados, combina los RFLPs y la PCR.

◆ SECUENCIAS

MICROSATELITES (SSRs): son secuencias simples repetidas, codominantes, muy polimórficas, pueden reconocer loci multialélicos.

TOMA Y PREPARACION DE LAS MUESTRAS

EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN •Protocolo  Hoinsington (1992), con láminas foliares en desarrollo. •La concentración y pureza del ADN se midió utilizando espectrofotómetro. • La calidad fue evaluada mediante electroforesis en geles de agarosa de concentración 0,8%.

Estandarización de AFLPs • ADN genómico se digirió con dos enzimas de restricción • Se acoplaron adapatadores con tres bases selectivas • Los fragmentos se separaron en geles de poliacrilamida • Se visualizaron mediante tinción con Nitrato de Plata

POLIMORFISMOS OBTENIDOS CON MARCADORES AFLPs EN GUADUA Fragmentos de ADN polimórficos en geles de poliacrilamida con tinción de plata

AFLP 771 bandas totales 382 bandas polimórficas (50.06%)

PROCESAMIENTO ESTADISTICO • Se analizaron 382 bandas polimórficas con el índice de similitud de Dice(1945),y la fórmula de Nei & Li(1979), • Los grupos se construyeron mediante el método UPGMA con el Ntsys-pc versión 2.02i • Análisis de Correspondencia Múltiple (SAS, Institute 1989)

076 G.angustifo 1028G.angustifo 1029G.angustifo

*** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***

Amazonas Antioquia Caldas Caquetá Cauca Córdoba Cundinamarca Huila Meta Nariño Putumayo Quindío Risaralda Santander Valle

1012G.angustifo 291Guaudasp2 1013Guaduasp3 1031G.angustifo G.angustivarnig 235G.angustifol 343G.angustifol 345G.angustifol 392G.angustifol 418G.angustifol 416G.angustifol Cebolla1 Criolla G.angustivarnig 397G.angustifol 887G.angustifol G.angustifolia( Cotuda Macana1 366G.affangusti 375G.angustifol 281G.affangusti 233G.angustifol G.angustivarbic Macana2 Cebolla2 Cebolla3 Pepina G.angustifolia( 109G.uncinata 144G.sp1 214G.sp1 413G.amplexifol 1027G.angustifo 303G.angustifol Castilla 344G.angustifol 206G.angustifol 399G.angustifol Grandicaula Macana3 Macana4 Macana 1016G.angustifo 1019G.angustifo 1026Guaduasp4 289G.angustifol 1006G.amplexifo 536G.macrospicu G.affamplexifol 1003G.amplexifo 542G.superba

UTILIZACION DE SECUENCIAS MICROSATELITES DE ARROZ y CAÑA DE AZÚCAR PARA EVALUAR DIVERSIDAD GENETICA EN ACCESIONES DE Guadua spp.

JUSTIFICACION • Regiones altamente conservadas del genoma de arroz tienen la capacidad de amplificar diferentes loci en maíz y otras especies de la familia Poaceae (Zhao y Kochert, 1993; Kresovich et al, 1995)

• Sorgo, Maíz y Caña de Azúcar presentan sintenia en varios segmentos de sus cromosomas y perfecta colinearidad (Paterson, 1995; Benntzen, 1996; Guimaraes, 1997)

Secuencias microsatélites evaluadas • 47 secuencias microsatélites de arroz RM (Gramene Cornell Microsatellite RM Markers) • 10 secuencias microsatélite de caña de azúcar (CIR) desarrolladas por CIRAD (Centre de coopération internationale en recherche agronomique pour le developpmemt)

Sintenía Algunos estudios han indicado que especies vegetales relacionadas filogenéticamente han conservado notablemente el contenido y la localización cromosómica de sus genes

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Amplificación y polimorfismo de las secuencias evaluadas • 27 secuencias RM amplificaron, RM 31, RM 309, RM 32 presentaron polimorfismo en los patrones de bandas en las 55 accesiones de guadua. • 10 secuencias de caña de azúcar amplificaron, solo CIR 23 presentó polimorfismo en las 55 accesiones de guadua.

Grupo 1 Dendrograma con el índice de similitud de Dice

Grupo 2

Grupo 3

Grupo 4

Grupo 5 Grupo 6

G.angustifolia G.angustifolia G.angustifolia G.angustifolia

G R U P O 1

G.angustifolia G.angustifolia G.angustifolia

Grupo 1

G.amplexifolia G.amplexifolia G.angustifolia G.angustifolia G.angustifolia G.angustifolia G.superba G.angustifolia G.angustifolia G.amplexifolia

Grupo 2

Guaduasp1

G2

Guaduasp1 G.angustifolia G.angustifolia G.angustifolia

G R U P O 3

G.angustifolia G.angustifolia Guaduasp3 Guaduasp4 G.angustifolia

Grupo 3

G.aff.angustifo G.angustifolia G.aff.angustifo G.angustifolia Guaduasp2 G.angustifolia

G4

Grupo 4

G.uncinata 0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Distancia Euclidiana

Dendrograma basado en datos morfológicos de accesiones del Género Guadua

13.00

Guaduasp4

G.angustifolia

Guaduasp3

G.superba

G.angustifolia

G.angustifolia

G.angustifolia G.angustifolia G.angustifolia G.angustifolia G.angustifolia

G.angustifolia G.angustifolia

G.angustifolia G.angustifolia

G.angustifolia 2.25

G.angustifolia G.angustifolia

G.aff.angustifo G.angustifolia

G.angustifolia G.amplexifolia G.amplexifolia

G.amplexifolia

G.angustifolia G.angustifolia

G.aff.angustifo

G.angustifolia Guaduasp2 G.angustifolia

Dim-2 -8.50 G.angustifolia

-19.25

G.uncinata

Guaduasp1 Guaduasp1 -30.00 -25.00

-12.50

0.00

12.50

Dim-1

Análisis de Coordenadas Principales con datos morfológicos

25.00

CONCLUSIONES • Los AFLP discriminaron cada una de las 55 accesiones generando patrones únicos de bandas, aunque muchos de los biotipos mostraron patrones electroforéticos bastante similares.

• Se evidencia la existencia de un nivel considerable de variabilidad entre las especies de Guadua evaluadas, y un nivel menor de diferenciación genética dentro de las accesiones de Guadua angustifolia.

• Las especies G. amplexifolia, G. uncinata, G. macrospiculata y G. superba formaron grupos separados de G. angustifolia, con los AFLP. • CIR 23 diferenció G. uncinata, G. amplexifolia y G. angustifolia. • Los micros y los AFLP evidenciaron la existencia de al menos dos acervos genéticos de G. angustifolia en Colombia

• Las guaduas conocidas como cebolla, macana, cotuda, criolla, castilla y pepina son biotipos o formas genéticas con diferencias moleculares intra específicas de G angustifolia . Las variedades G angustifolia var nigra y G angustifolia var bicolor se separan por mayores distancias genéticas. • Los genotipos de G. angustifolia procedentes de Antioquia, Cundinamarca, Caquetá, Nariño, Meta, Santander y Norte de Santander, se separan de las accesiones del eje cafetero por mayores distancias genéticas.

• Los datos morfológicos dieron origen a cuatro grupos de similitud que permiten inferir la distribución geográfica de la variabilidad genética del género Guadua en Colombia.