Aula 10 e 11 - Analise de Proteinas

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Analise de proteínas

1. Eletroforese 1.1 SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Cuba e fonte eletroforética

1.1 SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Gel de poliacrilamida

1.1 SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Principio da separação

1.1 SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Principio da separação

1.1 SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) Revelação da eletroforese

Comassie blue

1.1 SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Estimativa do peso molecular de uma proteína

1.2 Focalização isoelétrica

1.2 Focalização isoelétrica Ponto isoelétrico de algumas proteínas

1.3 Eletroforese bidimensional

1.3 Eletroforese bidimensional

Gel de eletroforese bidimensional

2. Analise de proteínas por espectrometria de massa

2.1 Analise de MALDI-TOF ionization Time of flight)

(matrix-assisted laser desorption-

2. Analise de proteínas por espectrometria de massa

2.1 Analise de MALDI-TOF ionization Time of flight)

(matrix-assisted laser desorption-

Espectro de MALDI-TOF MS de uma mistura de proteínas

3. Purificação de proteínas 3.1 Extração de proteínas

Centrigugaçao

Isolamento de celulas bacterianas

Meio de cultura contendo bactérias

Lise das células

Precipitação das proteínas

3.2 Precipitação de proteínas: Salting out

3.3 Diálise: Remoção do sal

3.4 Cromatografia:

3.4 Cromatografia: Gel filtração

3.4 Cromatografia: troca iônica

3.4 Cromatografia: afinidade

3.4 Cromatografia: afinidade

Fonte: http://www.clontech.com/US/Support/Applications/Tagged_Protein_Purification/Ni-NTA_Resin_vs_His60 Block et al.,. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. In Methods in Enzymology, vol. 463, cap. 27, p. 439, 2009.

3.5 Exemplo de procedimento de purificação de uma proteína

Mistura de proteínas

Enzima alvo

Após precipitação com sulfato de amônio

3.5 Exemplo de procedimento de purificação de uma proteína

Enzima alvo

Cromatografia de gel filtração

3.5 Exemplo de procedimento de purificação de uma proteína

Enzima alvo

Cromatografia de troca iônica

3.5 Exemplo de procedimento de purificação de uma proteína

Enzima alvo

Cromatografia de afinidade

3.5 Exemplo de procedimento de purificação de uma proteína

Acompanhamento da purificação de uma enzima

4. Sequenciamento de peptídeos e proteínas

Sequência de aminoácidos da insulina bovina

4. Sequenciamento de peptídeos e proteínas

Determinação do amino-terminal

Degradação de Edman

4. Sequenciamento de peptídeos e proteínas

4. Sequenciamento de peptídeos e proteínas

4. Sequenciamento de peptídeos e proteínas

4. Sequenciamento de peptídeos e proteínas

4. Sequenciamento de peptídeos e proteínas

Lys = K Arg = R

4. Sequenciamento de peptídeos e proteínas

Rompimento das ligações dissulfeto em proteínas

4.1 Analise de sequência

P-loop (ligador de ATP)

EF hand (ligador de Ca2+)

4.1 Analise de sequência

Referências adicionais: http://www.clontech.com/US/Support/Applications/Tagged_Protein_Purification/NiNTA_Resin_vs_His60

Block et al.,. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. In Methods in Enzymology, vol. 463, cap. 27, p. 439, 2009. http://www.agbooth.com/pp_ajax/ (site para purificação de proteína)

Sumario 1.

Eletroforese 1.1 SDS-PAGE 1.2 Focalização isoelétrica 1.3 Eletroforese bidimensional

2. Analise de proteínas por espectrometria de massa 2.1 MALDI-TOF 3. Purificação de proteínas 3.1 Extração de proteínas 3.2 Precipitação de proteínas (salting out) 3.3 Diálise 3.4 Cromatografia (gel filtração, troca iônica, afinidade) 3.5 Exemplo de procedimento de purificação de uma proteína 4. Sequenciamento de peptídeos e proteínas 4.1 Análise da sequência