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UBI
Portugal
“BIOTECNOLOGIA DE EMBRIÕES”
Prof. Dr. Halim Atique Netto
Embriões In vitro
Oócitos colhidos por Punção Folicular são processados em laboratório e geram embriões
In vivo
Embriões são colhidos de doadoras previamente superovuladas e inseminadas
Produção in vivo de embriões
Superovulação em Bovinos
Superovulação - Animais geneticamente superiores - Melhoramento genético da pecuária - Técnica mais antiga
“ Vaca naturalmente ovula um óvulo a cada 21 dias”
“ Embriões são produzidos no útero das fêmeas, sem uso de laboratório”
“Como ?”
“Indução com hormônios para que vários folículos cresçam nos ovários”
Como fazer uma vaca Superovular ? • Estimulando uma super - foliculogênese
• Permitir que um pool de folículos ovulatórios atinja a ovulação
• Suplementar por via exógena um aporte de FSH, antes do desvio folicular, que permita que vários folículos cheguem a fase pré-ovulatória
Desvio - LH
Crescimento - FSH
Recrutamento - FSH
FOLICULOGÊNESE E OVULAÇÃO
FSH FSH FSH FSH
D0
D5
D10
D17
Cio
Desvio - LH
Crescimento - FSH
FSH Recrutamento - FSH
FSH FSH
FSH
D21
Os Protocolos de Superovulação Fundamentos • Início de aplicação em dias de crescimento folicular (geral// entre o D9 e D12) • Hormônios em geral de curta vida média – injeções 12 em 12 hs • O período de indução dura de 4 a 5 dias • As doses são decrescentes e por via intra-muscular
Protocolos – SEM CIO BASE F . S . H. M
D0
M
T
T
D5
D6
M T
T
C I O
D7
D8
D9
Implante de Progesterona
Benzoato de estradiol
P G F2 ALFA
M
Coleta e TE
D16
IA Qualquer dia do ciclo
Exemplo Prático de Superovulação 3,2 ml Dia 05 3,2 ml
Fooltropin - 40 mg 20 ml
2,4 ml Dia 06 2,4 ml 1,6 ml * 3,0 ml Ciosin
Vol. Final = 16 ml Dose Total = 32 mg.
Dia 07 1,6 ml
Vaca Adulta
0,8 ml Dia 08 Ret. P4 0,8 ml
No D 09 entrou em Cio
PROTOCOLO TRADICIONAL
PGF2
WILTBANK, M.C. (1996)
OBS.CIO FSH FSH FSH FSH d0
d10
d11 d12
d13
OBS.CIO+IA
Inseminação Artificial • Em geral, 12 horas após a última dose de FSH, a doadora entra em cio
• São realizadas 2 ou 3 inseminações com intervalos de 8 ou 12 horas
• A última IA é realizada geralmente com a doadora fora do cio
Fig. 13-9
+
Colheita de Embriões
A colheita dos embriões é efetuada ao sétimo dia depois do dia onde a doadora recebeu pelo menos duas inseminações
Colheita de Embriões Ao 7o dia = ↑ probabilidade embriões no útero
Neste momento = embriões próximos junção útero-tubárica
Estágios embrionários compatíveis e de interesse são: Mórula (Mo); Jovem Blastocisto (Bi); Blastocisto (Bl) e Blastocisto Expandido (Bx)
Colheita de Embriões • Contenção em brete seguro • Anestesia epidural – lidocaína 2% 4-5ml
• Limpeza e assepsia da região perineal e vulvar • Introdução de sonda Foley por via vaginal em corno uterino com guia de aço inox • Infla-se balão de ar no terço médio de um corno uterino (20 ml de ar)
• Retirada do guia
Colheita de Embriões • Acoplagem do sistema de mangueiras e PBS
• Fluxo e refluxo de PBS em câmara uterina (envio de frações de 40 a 50 ml de PBS na câmera uterina) • Abre e fecha – fluxo refluxo total 500 ml por corno • Auxílio da lavagem com massagem por via retal. • Recuperação em filtro coletor
Colheita de Embriões PBS + 1% Soro Fetal Bovino Frascos de 500 ml Sonda de Foley ou derivados
Procura e Seleção de embriões
Seleção e Processamento de Embriões • Logo após colheita - filtro coletor é levado ao laboratório • Banho no filtro com o meio PBS (tampão fosfato-salino ou phosphate buffered saline) - auxílio de seringa e agulha • Deposição de líquido em placas de Petri • Busca e seleção de embriões em Microscópio Estereoscópio 40 a 100X
Processo e Seleção de Embriões
• Estruturas encontradas são capturadas e lavadas várias vezes em meio PBS+0,4% BSA (Albumina Sérica Bovina)
• Manipulação feita com auxílio de ponteira ou micropipetador
• Embriões envasados palhetas de 0,25 ml individualmente
Fig. 13-1
Fig. 13-1
Fig. 13-1
Fig. 13-1
Fig. 13-1
Fig. 13-1
Seleção e Processamento de Embriões
10 Banhos Sanitários PBS + 0,4% BSA
MÓRULA
Zona Pelúcida
Espaço Perivitelínico
Massa embrionária bastante compacta. Contornos celulares visíveis na periferia. Passível de biópsia e bissecção. Fase de TE em humanos e bovinos. 64 a 110 células
Massa Embrionária
D6aD7
JOVEM BLASTOCISTO Blastocele Trofoblasto
E.P.V. Massa Embrionária
Vacuolização de céls periféricas. Início de formação do Trofoblasto e Blastocele Fase para Biópsia de Trofoblasto Idade para Transferência no Útero 90 a 110 células
D6-D7
BLASTOCISTO Blastocele Trofoblasto
Botão Embrionário
Blastocele ocupa 50% do V. embrionário Polarização do BE e Trofoblasto Fase de Transferência no Útero Ótima idade para Biópsia e Bissecção
D7-D8
BLASTOCISTO Trofoblasto
Blastocele
Botão Embrionário
Diferenciação acentuada do BE Desaparecimento do EPV Transferência 120 a 160 Células
D7-D8
BLASTOCISTO EXPANDIDO 180 micras Z. Pelúcida
Trofoblasto Blastocele Botão Embrionário Aumento da Pressão Intraembrionária Adelgaçamento da ZP Aumento do diâmetro do embrião. Botão embrionário pequeno 160 a 210 células
D7-D8
BLASTOCISTO EM ECLOSÃO
Protrusão do Trofoblasto D8-D9
BLASTOCISTO ECLODIDO
D 8 - D 9 - D10
AVALIAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO DE EMBRIÕES
Qualidade Embrionária ---------------------------------------------• Código 1 Excelente ou Bom • Código 2 Regular • Código 3 Pobre • Código 4 Morto ou Degenerado ---------------------------------------------IETS 1998
CLASSIFICAÇÃO Qualidade 1 • Excelente - embrião em desenvolvimento compatível com sua idade e sem nenhum defeito citológico visível • Bom - embrião em desenvolvimento compatível com sua idade e com um defeito citológico: blastômero no EPV
CLASSIFICAÇÃO Qualidade 2 • Embrião em desenvolvimento compatível com sua idade e com 2 defeitos citológicos: extrusão de 2 blastômeros; alguns grânulos no citoplasma; blastômeros assimétricos.
CLASSIFICAÇÃO Qualidade 3 • Embrião em desenvolvimento compatível com sua idade e vários defeitos citológicos: zona pelúcida oval; muitos grânulos citoplasmáticos; coloração alterada
CLASSIFICAÇÃO Qualidade 4 ou degenerado • Embrião em desenvolvimento incompatível com sua idade. Morto. Deve ser descartado
Envase e Transporte para TE
Viabilidade inalterada até 8 Horas. Transporte em caixa de isopor a temp. ambiente Transportador de embriões
Transferência dos Embriões • Receptoras devem sincronizadas com doadoras
• Cio: 24hs antes da doadora, mesmo dia ou 24hs após doadora
• Sincronização com Pgf2α ou implante IATF
Embriões da Doadora
receptoras
SOV/TE - Comentários finais • Superovulação está sendo pouco utilizada hoje no Brasil pela chegada da FIV
• Embriões podem ser congelados com bons resultados de prenhez
Muito Obrigado!
Produção in vitro de Embriões em Bovinos
Produção de embriões em laboratório
FIV X ICSI
FIV X ICSI • Processo Normal de fertilização: sptz-zp, reação acrossômica, fusão, e penetração na membrana plasmática.
• ICSI: deposição da célula espermática diretamente no citoplasma do oócito.
FIV X ICSI
ICSI
FIV
Como gerar embriões in vitro ? • Mimetizar ou copiar em laboratório todas as condições fisiológicas da vaca durante a ovulação, fecundação e desenvolvimento embrionário
• Estes fenômenos fisiológicos que duram 8 dias coincidem com as fases de estro, metaestro e início do diestro
Como criar condições fisiológicas ? • TEMPERATURA – 38,5°C
• PRESSÃO ATMOSFÉRICA – 5% CO2
• UMIDADE RELATIVA – 90 %
• Meios Específicos de cultivo celular
Como criar condições fisiológicas ?
• ESTERELIZAÇÃO - TOTAL
• TOXICIDADE – NULA
Estufas / Incubadoras
38,5°C - 5% CO2 – UR 90
MEIOS DE CULTURA
A composição dos meios de cultura e o requerimento dos embriões mudam de acordo com o estágio de desenvolvimento na trompa, no útero ou nos folículos
ETAPAS • Obtenção dos oócitos - Aspiração folicular • Transporte da fazenda ao laboratório • Maturação in vitro • Fertilização in vitro • Cultivo in vitro
• Transferência dos embriões
Obtenção dos oócitos
Obtenção dos oócitos Aspiração folicular
-Experimentos -Pesquisas
Obtenção dos oócitos ABATEDOURO
Obtenção dos oócitos OPU: ASPIRAÇÃO FOLICULAR GUIADA POR ULTRA-SONOGRAFIA Objetivo : obtenção in vivo de oócitos de animais de alto valor zootécnico
Ultra-som
Transdutor vaginal
Agulha 18G / 16G Contenção ovariana por via retal
Frasco de colheita
Bomba PBS + 10 UI HEPARINA
OPU – Ovum Pick Up Pieterse et. al. 1988
OPU
Obtenção dos oócitos de animais de alto valor zootécnico
Aspiração folicular in vivo ou OPU (ovum pick up)
SISTEMA DE ASPIRAÇÃO • Bomba de vácuo cria pressão negativa em tubo ligado a agulha • Agulha guiada através de guia especial ligada a aparelho de ultra-som
TUBOS DE COLETA
Seleção dos oócitos
Procura e Seleção dos Oócitos PBS + Soro Fetal Bovino + Heparina
Procura e Seleção dos Oócitos
Procura e Seleção dos Oócitos
Procura e Seleção dos Oócitos
Princípios básicos da morfologia oocitária
Complexos cumulus-oócito (COC) Ovócitos → substâncias reguladoras → células do cumulus → participação ativa no mecanismo de crescimento e maturação dos ovócitos. - Comunicação entre as células do cumulus e o oócito é bidirecional e essencial para a maturação nuclear e citoplasmática. -Conseqüentemente, ela viabiliza a competência do oócito para a fecundação e geração de um embrião com alto potencial de desenvolvimento
Oócitos Antes da MIV, oócitos classificados pelas características do citoplasma e das células do cumulus.
Potencial de viabilidade
• Ooplasma homogênio com granulações finas • Coloração marrom • Completamente envolvido por várias camadas de células do cumulus dispostas de forma compacta
Procura e Seleção dos Oócitos
Classificação com escala de 1 a 4 QUALIDADE 1:
•Cumulus compacto, com várias camadas de células (mais de três) •Ooplasma com granulações finas e homogêneas, preenchendo o interior da zona pelúcida e de coloração marrom
Classificação com escala de 1 a 4 QUALIDADE 2: •Cumulus compacto, parcialmente presente ao redor do oócito (ou rodeando completamente), com menos de 3 camadas celulares •Ooplasma, com granulações distribuídas heterogeneamente, podendo estar mais concentrada no centro e mais clara na periferia ou condensadas em um só local aparentando uma mancha escura. O ooplasma preenche o espaço do interior da zona pelúcida.
Classificação com escala de 1 a 4 QUALIDADE 3: •Cumulus presente, mas escasso ou expandido. •O citoplasma apresenta-se contraído, degenerado, fragmentado ou apresentando vacúolos.
QUALIDADE 4:
• Desnudo: o citoplasma possui granulações homogêneas, mas as células do cumulus estão ausentes. • Atrésicos: o citoplasma possui granulações irregulares e células do cumulus enegrecidas.
Transporte dos Oócitos - Tubos de 4 ml (Blondin et. al., 1995) - Estufa portátil (Byrd et al., 1995) - Placas em bolsas plásticas gaseificadas (Palma et. al., 1998) - Tubos Eppendorf® (Twagiramungu et. al., 1998) - Criotubos de 1 ml (Kaiser et. al., 1999) - Tubos mantidos em banho-maria (Kurtz, 2003) - Palhetas 0,25 ml (Rubin et. al., 2004)
Transporte dos Oócitos -
Hepes Soro fetal Piruvato Fsh Lh Estradiol Gentamicina Glutamina
• 36,0ºC • Transportador
Maturação oocitária in vitro (MIV)
Laboratório / MIV TCM 199 – Earles Soro Fetal Bovino Piruvato Gentamicina FSH LH Estradiol
Temperatura 38,5ºC 5% CO2 Umidade Saturada 20 a 22 horas
Recordando...Maturação oocitária in vivo Pico LH
Expansão cls cumulus Ativação MPF Prófase I a metáfase II Maturação citoplasmática
Maturação Citoplasmática
Maturação oocitária
Maturação oocitária in vitro Expansão das células do cumulus gonadotrofinas
24 h, 39°C, 5%CO2
COCs (15 – 20)
Expanção do cumulus
Oócitos imaturos
Oócito maturado (cumulus expandido)
Fecundação in vitro
Qualidade do sêmen
Diferença entre indivíduos
Partidas provadas
Laboratório / FIV Palheta de sêmen descongelada: - 35-37° C - 20 a 30 segundos
Preparo do sêmen Gradiente de PERCOLL
Centrifugação (1500rpm - 30 min)
Laboratório / FIV Seleção dos Espermatozóides
Centrifugação 30 minutos 1500 rpm
Meio Sêmen Talp
Laboratório / FIV Dose Inseminante 1x106 a 2x106 sptz / ml de meio
Fecundação in vitro • Realizada 24 h após o início maturação. • Sptzs separados do diluidor por centrifugação em gradiente de Percoll (45 e 90%), de 700 a 900xg durante 20-30 min • Aproximadamente 100x103 sptzs adicionados a cada gota de 100μL de meio (TALP-FIV ou FERT-TALP), contendo 20 a 40 oócitos por gota de FIV (5 a 2.500 sptz/oócito).
• Incubação: 38,5°C/ 18 a 20 h/ 5% de CO2 em ar e umidade saturada
Laboratório / FIV Meio FIV Capacitação espermática: epinefrina, penicilamina e hipotaurina Heparina: reação acrossomal
Temperatura 38,5ºC 5% CO2 Umidade Saturada 18 horas
Fecundação in vitro
TALP-FIV com Heparina + BSA 5% CO2, 39°C, 18 a 24 h
20 a 24 horas 38,5ºC – 5% CO2
Laboratório / CIV retirada do excesso de células do cúmulus e dos espermatozóides aderidos à membrana zigotos são transferidos a gotas de 50l com meio de cultivo específico (CIV) e permanecerão em incubadora por 7 dias
Cultivo in vitro
Cultivo in vitro
Cultivo in vitro
Meio de cultivo
• SOF (“Synthetic Oviduct Fluid”) • CR2 • TCM-199 (“Tissue Culture Medium”) • Meio sequencial 38,5ºC – 7 a 8 dias
Feeding (D4) -
Seleção mórulas Retirada de tapete celular Adição de meio (CR 2) Meio base Soro fetal bovino Alanina Glicina Albumina (fração 5) Gentamicina
- Previsão ao criador
D7
Blastocistos Expandidos
D7
D7
Blastocisto Inicial
Blastocisto Expandido
Blastocisto em eclosão
Blastocisto Inicial
Blastocisto
Blastocisto Eclodido
Degenerado
Blastocisto Expandido
Blastocistos Eclodidos
Classificação e Envase dos Embriões (D7) CR2
EMBRIÃO AR
AR
Transporte dos Embriões
Transferência dos Embriões
Transferência dos Embriões • Observação de cio ou TETF - Classificação C.L.
Transferência dos Embriões P4
PgF ECG E2
BE
CIO
Reconhecimento Materno da Gestação
TETF
P4
D0
D8 D9 D10
OPU
D17
Diferenças entre SOV e PIV In vivo (Superovulação)
In vitro (Laboratório)
Índice de prenhez 60% Blastocisto com 140 céls Congelamento eficiente 50% F e 50% M 2 Doses de Sêmen/Vaca/SO Multip. Mais lenta Com hormônios
Índice de prenhez 45% Blastocisto com 120 céls. Congelamento ineficiente 60%M e 40%F 1 Dose para até 10 Vacas Multip. Mais rápida Sem hormônios
Muito Obrigado!
Biotécnicas aplicadas a embriões produzidos in vivo ou in vitro
Dificuldade congelação - Embriões PIV
Diferenças entre embriões PIV e produzidos in vivo: Zona pelúcida: maior sensibilidade à atividade enzimática Maior quantidade de lipídios intracelular Menor capacidade de compactação dos blastômeros: complexos juncionais menores e em menor quantidade Adequada maturação citoplasmática (?) - pior qualidade embrionária (?)
Sexagem de embriões • Permite a identificação do sexo do embrião • Direcionamento da cadeia de produção – machos ou fêmeas
• Retira-se um fragmento através de micro manipulação do embrião com 7 dias • Técnica de eletroforese evidenciará através do DNA qual é o sexo do embrião • Método invasivo, porém funcional
Bipartição Embrionária • Divisão de um embrião através de micromanipulação em duas partes • Produção de gêmeos • Técnica pioneira em estudos de clonagem • Custo do equipamento (micromanipulador) é elevado • Mão-de-obra especializada (treinamento)
BIOTECNOLOGIAS • Bipartição Embrionária
Congelação de Embriões Bovinos
Congelação de Embriões Bovinos • criopreservação • N2 (- 196ºC) • metabolismo celular quiescência • conservação por tempo indeterminado
Congelação de Embriões Bovinos Etapas – Congelação tradicional – Método Lento - Exposição do embrião à solução crioprotetora (diferentes crioprotetores e associações) - Resfriamento - Armazenamento N2 - Aquecimento (descongelação) - Remoção do crioprotetor - Transferência para receptoras
Máquina de congelar embriões
Vitrificação • Congelação ultra-rápida • Nitrogênio líquido • Vários crioprotetores e associações • Diminui a formação de cristais de gelo intra-celular • Diminui danos ao embrião
• Reidratação embrião
Congelação de Embriões Bovinos • Sucesso com embriões produzidos in vivo • 50% a 60% de prenhez • Embriões in vitro • 20% a 40% de prenhez • Vitrificação
BIOTECNOLOGIAS Transferência nuclear (clonagem)
BIOTECNOLOGIAS Transferência nuclear (clonagem)
Clonagem Células somáticas embrionárias ou adultas • Blastômeros • Cels granulosa • Fibroblastos • Cels epiteliais • Cels gls mamárias • Cels oviduto • Cels musculares • Leucócitos
-
- Injeção direta no citoplasto Introdução do núcleo no espaço perivitelíneo
- Pulsos elétricos ou substs químicas (fusão mbs e ativação oocitária- influxo Ca2+ )
BIOTECNOLOGIAS • Transferência nuclear (clonagem)
BIOTECNOLOGIAS TRANSGENIA
BIOTECNOLOGIAS • Transgênese: por que produzir animais transgênicos? • Novos conhecimentos • Produzir rebanhos e/ou animais resistentes geneticamente à doenças
• Melhorar caracteres produtivos dos animais (por ex. alteração benéfica da composição do leite, de forma a produzir queijo de melhor qualidade, leite com mais ptns, sem substâncias alergênicas ou não toleradas, proteínas terapêuticas, animais com maiores índices de crescimento) • Produzir fármacos de alta complexidade biológica a partir de fluidos corporais dos animais geneticamente modificados
BIOTECNOLOGIAS • Transgênese: • injeção pronuclear de DNA exógeno • Uso de retrovírus (infeção de embriões com vetores contendo DNA exógeno)
Fibroblastos de ovelhas transfectados com fator IX humano + transferência nuclear = duas ovelhas clonadas produziram altos níveis de fator IX na 1ª lactação
Muito Obrigado!