Biotecnologia de Embrioes-Prof. Halim

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UBI

Portugal

“BIOTECNOLOGIA DE EMBRIÕES”

Prof. Dr. Halim Atique Netto

Embriões In vitro

Oócitos colhidos por Punção Folicular são processados em laboratório e geram embriões

In vivo

Embriões são colhidos de doadoras previamente superovuladas e inseminadas

Produção in vivo de embriões

Superovulação em Bovinos

Superovulação - Animais geneticamente superiores - Melhoramento genético da pecuária - Técnica mais antiga

“ Vaca naturalmente ovula um óvulo a cada 21 dias”

“ Embriões são produzidos no útero das fêmeas, sem uso de laboratório”

“Como ?”

“Indução com hormônios para que vários folículos cresçam nos ovários”

Como fazer uma vaca Superovular ? • Estimulando uma super - foliculogênese

• Permitir que um pool de folículos ovulatórios atinja a ovulação

• Suplementar por via exógena um aporte de FSH, antes do desvio folicular, que permita que vários folículos cheguem a fase pré-ovulatória

Desvio - LH

Crescimento - FSH

Recrutamento - FSH

FOLICULOGÊNESE E OVULAÇÃO

FSH FSH FSH FSH

D0

D5

D10

D17

Cio

Desvio - LH

Crescimento - FSH

FSH Recrutamento - FSH

FSH FSH

FSH

D21

Os Protocolos de Superovulação Fundamentos • Início de aplicação em dias de crescimento folicular (geral// entre o D9 e D12) • Hormônios em geral de curta vida média – injeções 12 em 12 hs • O período de indução dura de 4 a 5 dias • As doses são decrescentes e por via intra-muscular

Protocolos – SEM CIO BASE F . S . H. M

D0

M

T

T

D5

D6

M T

T

C I O

D7

D8

D9

Implante de Progesterona

Benzoato de estradiol

P G F2 ALFA

M

Coleta e TE

D16

IA Qualquer dia do ciclo

Exemplo Prático de Superovulação 3,2 ml Dia 05 3,2 ml

Fooltropin - 40 mg 20 ml

2,4 ml Dia 06 2,4 ml 1,6 ml * 3,0 ml Ciosin

Vol. Final = 16 ml Dose Total = 32 mg.

Dia 07 1,6 ml

Vaca Adulta

0,8 ml Dia 08 Ret. P4 0,8 ml

No D 09 entrou em Cio

PROTOCOLO TRADICIONAL

PGF2

WILTBANK, M.C. (1996)

OBS.CIO FSH FSH FSH FSH d0

d10

d11 d12

d13

OBS.CIO+IA

Inseminação Artificial • Em geral, 12 horas após a última dose de FSH, a doadora entra em cio

• São realizadas 2 ou 3 inseminações com intervalos de 8 ou 12 horas

• A última IA é realizada geralmente com a doadora fora do cio

Fig. 13-9

+

Colheita de Embriões

A colheita dos embriões é efetuada ao sétimo dia depois do dia onde a doadora recebeu pelo menos duas inseminações

Colheita de Embriões Ao 7o dia = ↑ probabilidade embriões no útero

Neste momento = embriões próximos junção útero-tubárica

Estágios embrionários compatíveis e de interesse são: Mórula (Mo); Jovem Blastocisto (Bi); Blastocisto (Bl) e Blastocisto Expandido (Bx)

Colheita de Embriões • Contenção em brete seguro • Anestesia epidural – lidocaína 2% 4-5ml

• Limpeza e assepsia da região perineal e vulvar • Introdução de sonda Foley por via vaginal em corno uterino com guia de aço inox • Infla-se balão de ar no terço médio de um corno uterino (20 ml de ar)

• Retirada do guia

Colheita de Embriões • Acoplagem do sistema de mangueiras e PBS

• Fluxo e refluxo de PBS em câmara uterina (envio de frações de 40 a 50 ml de PBS na câmera uterina) • Abre e fecha – fluxo refluxo total 500 ml por corno • Auxílio da lavagem com massagem por via retal. • Recuperação em filtro coletor

Colheita de Embriões PBS + 1% Soro Fetal Bovino Frascos de 500 ml Sonda de Foley ou derivados

Procura e Seleção de embriões

Seleção e Processamento de Embriões • Logo após colheita - filtro coletor é levado ao laboratório • Banho no filtro com o meio PBS (tampão fosfato-salino ou phosphate buffered saline) - auxílio de seringa e agulha • Deposição de líquido em placas de Petri • Busca e seleção de embriões em Microscópio Estereoscópio 40 a 100X

Processo e Seleção de Embriões

• Estruturas encontradas são capturadas e lavadas várias vezes em meio PBS+0,4% BSA (Albumina Sérica Bovina)

• Manipulação feita com auxílio de ponteira ou micropipetador

• Embriões envasados palhetas de 0,25 ml individualmente

Fig. 13-1

Fig. 13-1

Fig. 13-1

Fig. 13-1

Fig. 13-1

Fig. 13-1

Seleção e Processamento de Embriões

10 Banhos Sanitários PBS + 0,4% BSA

MÓRULA

Zona Pelúcida

Espaço Perivitelínico

Massa embrionária bastante compacta. Contornos celulares visíveis na periferia. Passível de biópsia e bissecção. Fase de TE em humanos e bovinos. 64 a 110 células

Massa Embrionária

D6aD7

JOVEM BLASTOCISTO Blastocele Trofoblasto

E.P.V. Massa Embrionária

Vacuolização de céls periféricas. Início de formação do Trofoblasto e Blastocele Fase para Biópsia de Trofoblasto Idade para Transferência no Útero 90 a 110 células

D6-D7

BLASTOCISTO Blastocele Trofoblasto

Botão Embrionário

Blastocele ocupa 50% do V. embrionário Polarização do BE e Trofoblasto Fase de Transferência no Útero Ótima idade para Biópsia e Bissecção

D7-D8

BLASTOCISTO Trofoblasto

Blastocele

Botão Embrionário

Diferenciação acentuada do BE Desaparecimento do EPV Transferência 120 a 160 Células

D7-D8

BLASTOCISTO EXPANDIDO 180 micras Z. Pelúcida

Trofoblasto Blastocele Botão Embrionário Aumento da Pressão Intraembrionária Adelgaçamento da ZP Aumento do diâmetro do embrião. Botão embrionário pequeno 160 a 210 células

D7-D8

BLASTOCISTO EM ECLOSÃO

Protrusão do Trofoblasto D8-D9

BLASTOCISTO ECLODIDO

D 8 - D 9 - D10

AVALIAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO DE EMBRIÕES

Qualidade Embrionária ---------------------------------------------• Código 1 Excelente ou Bom • Código 2 Regular • Código 3 Pobre • Código 4 Morto ou Degenerado ---------------------------------------------IETS 1998

CLASSIFICAÇÃO Qualidade 1 • Excelente - embrião em desenvolvimento compatível com sua idade e sem nenhum defeito citológico visível • Bom - embrião em desenvolvimento compatível com sua idade e com um defeito citológico: blastômero no EPV

CLASSIFICAÇÃO Qualidade 2 • Embrião em desenvolvimento compatível com sua idade e com 2 defeitos citológicos: extrusão de 2 blastômeros; alguns grânulos no citoplasma; blastômeros assimétricos.

CLASSIFICAÇÃO Qualidade 3 • Embrião em desenvolvimento compatível com sua idade e vários defeitos citológicos: zona pelúcida oval; muitos grânulos citoplasmáticos; coloração alterada

CLASSIFICAÇÃO Qualidade 4 ou degenerado • Embrião em desenvolvimento incompatível com sua idade. Morto. Deve ser descartado

Envase e Transporte para TE

Viabilidade inalterada até 8 Horas. Transporte em caixa de isopor a temp. ambiente Transportador de embriões

Transferência dos Embriões • Receptoras devem sincronizadas com doadoras

• Cio: 24hs antes da doadora, mesmo dia ou 24hs após doadora

• Sincronização com Pgf2α ou implante IATF

Embriões da Doadora

receptoras

SOV/TE - Comentários finais • Superovulação está sendo pouco utilizada hoje no Brasil pela chegada da FIV

• Embriões podem ser congelados com bons resultados de prenhez

Muito Obrigado!

Produção in vitro de Embriões em Bovinos

Produção de embriões em laboratório

FIV X ICSI

FIV X ICSI • Processo Normal de fertilização: sptz-zp, reação acrossômica, fusão, e penetração na membrana plasmática.

• ICSI: deposição da célula espermática diretamente no citoplasma do oócito.

FIV X ICSI

ICSI

FIV

Como gerar embriões in vitro ? • Mimetizar ou copiar em laboratório todas as condições fisiológicas da vaca durante a ovulação, fecundação e desenvolvimento embrionário

• Estes fenômenos fisiológicos que duram 8 dias coincidem com as fases de estro, metaestro e início do diestro

Como criar condições fisiológicas ? • TEMPERATURA – 38,5°C

• PRESSÃO ATMOSFÉRICA – 5% CO2

• UMIDADE RELATIVA – 90 %

• Meios Específicos de cultivo celular

Como criar condições fisiológicas ?

• ESTERELIZAÇÃO - TOTAL

• TOXICIDADE – NULA

Estufas / Incubadoras

38,5°C - 5% CO2 – UR 90

MEIOS DE CULTURA

A composição dos meios de cultura e o requerimento dos embriões mudam de acordo com o estágio de desenvolvimento na trompa, no útero ou nos folículos

ETAPAS • Obtenção dos oócitos - Aspiração folicular • Transporte da fazenda ao laboratório • Maturação in vitro • Fertilização in vitro • Cultivo in vitro

• Transferência dos embriões

Obtenção dos oócitos

Obtenção dos oócitos Aspiração folicular

-Experimentos -Pesquisas

Obtenção dos oócitos ABATEDOURO

Obtenção dos oócitos OPU: ASPIRAÇÃO FOLICULAR GUIADA POR ULTRA-SONOGRAFIA Objetivo : obtenção in vivo de oócitos de animais de alto valor zootécnico

Ultra-som

Transdutor vaginal

Agulha 18G / 16G Contenção ovariana por via retal

Frasco de colheita

Bomba PBS + 10 UI HEPARINA

OPU – Ovum Pick Up Pieterse et. al. 1988

OPU

Obtenção dos oócitos de animais de alto valor zootécnico

Aspiração folicular in vivo ou OPU (ovum pick up)

SISTEMA DE ASPIRAÇÃO • Bomba de vácuo cria pressão negativa em tubo ligado a agulha • Agulha guiada através de guia especial ligada a aparelho de ultra-som

TUBOS DE COLETA

Seleção dos oócitos

Procura e Seleção dos Oócitos PBS + Soro Fetal Bovino + Heparina

Procura e Seleção dos Oócitos

Procura e Seleção dos Oócitos

Procura e Seleção dos Oócitos

Princípios básicos da morfologia oocitária

Complexos cumulus-oócito (COC) Ovócitos → substâncias reguladoras → células do cumulus → participação ativa no mecanismo de crescimento e maturação dos ovócitos. - Comunicação entre as células do cumulus e o oócito é bidirecional e essencial para a maturação nuclear e citoplasmática. -Conseqüentemente, ela viabiliza a competência do oócito para a fecundação e geração de um embrião com alto potencial de desenvolvimento

Oócitos  Antes da MIV, oócitos classificados pelas características do citoplasma e das células do cumulus.

Potencial de viabilidade

• Ooplasma homogênio com granulações finas • Coloração marrom • Completamente envolvido por várias camadas de células do cumulus dispostas de forma compacta

Procura e Seleção dos Oócitos

Classificação com escala de 1 a 4 QUALIDADE 1:

•Cumulus compacto, com várias camadas de células (mais de três) •Ooplasma com granulações finas e homogêneas, preenchendo o interior da zona pelúcida e de coloração marrom

Classificação com escala de 1 a 4 QUALIDADE 2: •Cumulus compacto, parcialmente presente ao redor do oócito (ou rodeando completamente), com menos de 3 camadas celulares •Ooplasma, com granulações distribuídas heterogeneamente, podendo estar mais concentrada no centro e mais clara na periferia ou condensadas em um só local aparentando uma mancha escura. O ooplasma preenche o espaço do interior da zona pelúcida.

Classificação com escala de 1 a 4 QUALIDADE 3: •Cumulus presente, mas escasso ou expandido. •O citoplasma apresenta-se contraído, degenerado, fragmentado ou apresentando vacúolos.

QUALIDADE 4:

• Desnudo: o citoplasma possui granulações homogêneas, mas as células do cumulus estão ausentes. • Atrésicos: o citoplasma possui granulações irregulares e células do cumulus enegrecidas.

Transporte dos Oócitos - Tubos de 4 ml (Blondin et. al., 1995) - Estufa portátil (Byrd et al., 1995) - Placas em bolsas plásticas gaseificadas (Palma et. al., 1998) - Tubos Eppendorf® (Twagiramungu et. al., 1998) - Criotubos de 1 ml (Kaiser et. al., 1999) - Tubos mantidos em banho-maria (Kurtz, 2003) - Palhetas 0,25 ml (Rubin et. al., 2004)

Transporte dos Oócitos -

Hepes Soro fetal Piruvato Fsh Lh Estradiol Gentamicina Glutamina

• 36,0ºC • Transportador

Maturação oocitária in vitro (MIV)

Laboratório / MIV TCM 199 – Earles Soro Fetal Bovino Piruvato Gentamicina FSH LH Estradiol

Temperatura 38,5ºC 5% CO2 Umidade Saturada 20 a 22 horas

Recordando...Maturação oocitária in vivo Pico LH    

Expansão cls cumulus Ativação MPF Prófase I a metáfase II Maturação citoplasmática

Maturação Citoplasmática

Maturação oocitária

Maturação oocitária in vitro Expansão das células do cumulus gonadotrofinas

24 h, 39°C, 5%CO2

COCs (15 – 20)

Expanção do cumulus

Oócitos imaturos

Oócito maturado (cumulus expandido)

Fecundação in vitro

Qualidade do sêmen

Diferença entre indivíduos

Partidas provadas

Laboratório / FIV Palheta de sêmen descongelada: - 35-37° C - 20 a 30 segundos

Preparo do sêmen Gradiente de PERCOLL

Centrifugação (1500rpm - 30 min)

Laboratório / FIV Seleção dos Espermatozóides

Centrifugação 30 minutos 1500 rpm

Meio Sêmen Talp

Laboratório / FIV Dose Inseminante 1x106 a 2x106 sptz / ml de meio

Fecundação in vitro • Realizada 24 h após o início maturação. • Sptzs separados do diluidor por centrifugação em gradiente de Percoll (45 e 90%), de 700 a 900xg durante 20-30 min • Aproximadamente 100x103 sptzs adicionados a cada gota de 100μL de meio (TALP-FIV ou FERT-TALP), contendo 20 a 40 oócitos por gota de FIV (5 a 2.500 sptz/oócito).

• Incubação: 38,5°C/ 18 a 20 h/ 5% de CO2 em ar e umidade saturada

Laboratório / FIV Meio FIV Capacitação espermática: epinefrina, penicilamina e hipotaurina Heparina: reação acrossomal

Temperatura 38,5ºC 5% CO2 Umidade Saturada 18 horas

Fecundação in vitro

TALP-FIV com Heparina + BSA 5% CO2, 39°C, 18 a 24 h

20 a 24 horas 38,5ºC – 5% CO2

Laboratório / CIV retirada do excesso de células do cúmulus e dos espermatozóides aderidos à membrana zigotos são transferidos a gotas de 50l com meio de cultivo específico (CIV) e permanecerão em incubadora por 7 dias

Cultivo in vitro

Cultivo in vitro

Cultivo in vitro

Meio de cultivo

• SOF (“Synthetic Oviduct Fluid”) • CR2 • TCM-199 (“Tissue Culture Medium”) • Meio sequencial 38,5ºC – 7 a 8 dias

Feeding (D4) -

Seleção mórulas Retirada de tapete celular Adição de meio (CR 2) Meio base Soro fetal bovino Alanina Glicina Albumina (fração 5) Gentamicina

- Previsão ao criador

D7

Blastocistos Expandidos

D7

D7

Blastocisto Inicial

Blastocisto Expandido

Blastocisto em eclosão

Blastocisto Inicial

Blastocisto

Blastocisto Eclodido

Degenerado

Blastocisto Expandido

Blastocistos Eclodidos

Classificação e Envase dos Embriões (D7) CR2

EMBRIÃO AR

AR

Transporte dos Embriões

Transferência dos Embriões

Transferência dos Embriões • Observação de cio ou TETF - Classificação C.L.

Transferência dos Embriões P4

PgF ECG E2

BE

CIO

Reconhecimento Materno da Gestação

TETF

P4

D0

D8 D9 D10

OPU

D17

Diferenças entre SOV e PIV In vivo (Superovulação)

In vitro (Laboratório)

Índice de prenhez 60% Blastocisto com 140 céls Congelamento eficiente 50% F e 50% M 2 Doses de Sêmen/Vaca/SO Multip. Mais lenta Com hormônios

Índice de prenhez 45% Blastocisto com 120 céls. Congelamento ineficiente 60%M e 40%F 1 Dose para até 10 Vacas Multip. Mais rápida Sem hormônios

Muito Obrigado!

Biotécnicas aplicadas a embriões produzidos in vivo ou in vitro

Dificuldade congelação - Embriões PIV

Diferenças entre embriões PIV e produzidos in vivo:  Zona pelúcida: maior sensibilidade à atividade enzimática  Maior quantidade de lipídios intracelular  Menor capacidade de compactação dos blastômeros: complexos juncionais menores e em menor quantidade  Adequada maturação citoplasmática (?) - pior qualidade embrionária (?)

Sexagem de embriões • Permite a identificação do sexo do embrião • Direcionamento da cadeia de produção – machos ou fêmeas

• Retira-se um fragmento através de micro manipulação do embrião com 7 dias • Técnica de eletroforese evidenciará através do DNA qual é o sexo do embrião • Método invasivo, porém funcional

Bipartição Embrionária • Divisão de um embrião através de micromanipulação em duas partes • Produção de gêmeos • Técnica pioneira em estudos de clonagem • Custo do equipamento (micromanipulador) é elevado • Mão-de-obra especializada (treinamento)

BIOTECNOLOGIAS • Bipartição Embrionária

Congelação de Embriões Bovinos

Congelação de Embriões Bovinos • criopreservação • N2 (- 196ºC) • metabolismo celular quiescência • conservação por tempo indeterminado

Congelação de Embriões Bovinos Etapas – Congelação tradicional – Método Lento - Exposição do embrião à solução crioprotetora (diferentes crioprotetores e associações) - Resfriamento - Armazenamento N2 - Aquecimento (descongelação) - Remoção do crioprotetor - Transferência para receptoras

Máquina de congelar embriões

Vitrificação • Congelação ultra-rápida • Nitrogênio líquido • Vários crioprotetores e associações • Diminui a formação de cristais de gelo intra-celular • Diminui danos ao embrião

• Reidratação embrião

Congelação de Embriões Bovinos • Sucesso com embriões produzidos in vivo • 50% a 60% de prenhez • Embriões in vitro • 20% a 40% de prenhez • Vitrificação

BIOTECNOLOGIAS Transferência nuclear (clonagem)

BIOTECNOLOGIAS Transferência nuclear (clonagem)

Clonagem Células somáticas embrionárias ou adultas • Blastômeros • Cels granulosa • Fibroblastos • Cels epiteliais • Cels gls mamárias • Cels oviduto • Cels musculares • Leucócitos

-

- Injeção direta no citoplasto Introdução do núcleo no espaço perivitelíneo

- Pulsos elétricos ou substs químicas (fusão mbs e ativação oocitária- influxo Ca2+ )

BIOTECNOLOGIAS • Transferência nuclear (clonagem)

BIOTECNOLOGIAS TRANSGENIA

BIOTECNOLOGIAS • Transgênese: por que produzir animais transgênicos? • Novos conhecimentos • Produzir rebanhos e/ou animais resistentes geneticamente à doenças

• Melhorar caracteres produtivos dos animais (por ex. alteração benéfica da composição do leite, de forma a produzir queijo de melhor qualidade, leite com mais ptns, sem substâncias alergênicas ou não toleradas, proteínas terapêuticas, animais com maiores índices de crescimento) • Produzir fármacos de alta complexidade biológica a partir de fluidos corporais dos animais geneticamente modificados

BIOTECNOLOGIAS • Transgênese: • injeção pronuclear de DNA exógeno • Uso de retrovírus (infeção de embriões com vetores contendo DNA exógeno)

Fibroblastos de ovelhas transfectados com fator IX humano + transferência nuclear = duas ovelhas clonadas produziram altos níveis de fator IX na 1ª lactação

Muito Obrigado!
Biotecnologia de Embrioes-Prof. Halim

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