Netter. Bioquímica esencial

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Netter. Bioquímica esencial Peter Ronner, PhD Professor of Biochemistry and Molecular Biology Professor of Pharmaceutical Sciences Department of Biochemistry and Molecular Biology Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Ilustraciones de

Frank H. Netter, MD Con la colaboración de

Carlos A.G. Machado, MD James A. Perkins, MS, MFA Kip Carter, MS, CMI Tiffany Davanzo, MA, CMI

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Índice de capítulos Cubierta Portada Página de créditos Dedicatoria Sobre el autor Agradecimientos Sobre el artista Prefacio Capítulo 1: El cariotipo humano y la estructura del ADN 1. Estructura química del ADN 2. Enlaces de hidrógeno entre bases complementarias 3. Doble hélice de ADN 4. Empaquetado de las dobles hélices de ADN en las cromátidas 5. Cambios en la topología del ADN 6. El cariotipo humano Resumen

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Capítulo 2: Reparación del ADN y tratamiento del cáncer 1. Reparación por escisión de bases 2. Reparación de errores de emparejamiento 3. Reparación por escisión de nucleótidos 4. Reparación de las roturas de la doble cadena y los enlaces cruzados intercatenarios 5. La respuesta al daño del ADN detiene el ciclo celular y regula la apoptosis Resumen Capítulo 3: Replicación del ADN 1. Replicación del ADN 2. Síntesis de ADN translesional 3. Replicación de los extremos de los cromosomas (telómeros) Resumen Capítulo 4: Pruebas clínicas basadas en el ADN o el ARN 1. Citogenética convencional e hibridación fluorescente in situ 2. Amplificación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa 3. Electroforesis y análisis de la curva de fusión del ADN 4. Tecnologías basadas en micromatrices de ADN 5. Secuenciado del ADN 6. Aplicaciones clínicas seleccionadas de las pruebas basadas en el ADN Resumen Capítulo 5: Genética básica para bioquímica

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1. Cromosomas y alelos 2. Impronta y patrones de herencia 3. Mutaciones y marcadores Resumen Capítulo 6: Transcripción y procesado del ARN 1. La metilación y el empaquetamiento del ADN impiden la transcripción 2. El proceso de la transcripción 3. Procesado del ARN durante y después de la transcripción Resumen Capítulo 7: Traducción y procesado postraduccional de las proteínas 1. Los codones y el código genético 2. ARN de transferencia 3. Los ribosomas traducen el ARNm en una proteína 4. Modificación postraduccional 5. Distribución de las proteínas y control de calidad Resumen Capítulo 8: Ciclo celular y cáncer 1. El ciclo celular y su regulación 2. Alteraciones genéticas en las células cancerosas 3. Ejemplos de neoplasias frecuentes 4. Consumo de glucosa por los tumores Resumen Capítulo 9: Estructura de las proteínas, y agregados de proteínas en las

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enfermedades degenerativas 1. Los aminoácidos como bloques de construcción de péptidos y proteínas 2. Enlaces peptídicos, puentes disulfuro y enlaces cruzados 3. Fuerzas que determinan la conformación de proteínas y péptidos 4. Elementos de la estructura tridimensional de las proteínas 5. Proteínas no estructuradas 6. Plegado de las proteínas 7. Desnaturalización de las proteínas 8. Enfermedades que se acompañan por una agregación excesiva de proteínas Resumen Capítulo 10: Enzimas y consecuencias de las carencias enzimáticas 1. Nomenclatura de las enzimas 2. Catálisis enzimática de reacciones químicas 3. Actividad enzimática en función de la concentración de sustratos 4. Activadores e inhibidores de las enzimas 5. Actividad enzimática y flujo en las rutas metabólicas 6. Enzimas de la sangre que tienen importancia clínica 7. Enzimoinmunoanálisis de adsorción Resumen Capítulo 11: Membranas biológicas 1. Estructura y composición de las membranas 2. Movimiento de moléculas a través de membranas Resumen

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Capítulo 12: Colágeno, colagenopatías y enfermedades de la mineralización 1. Biosíntesis y degradación de los colágenos fibrilares 2. Enfermedades del hueso que se asocian a los colágenos fibrilares 3. Colágeno tipo IV: un colágeno formador de redes 4. Colágeno tipo VII. El colágeno de las fibrillas de anclaje Resumen Capítulo 13: Alteraciones patológicas de la matriz extracelular que afectan a la fibrilina, la elastina o los proteoglucanos 1. Elastina y fibrilinas 2. Proteoglucanos y glucosaminoglucanos 3. Remodelado de la matriz extracelular Resumen Capítulo 14: Metabolismo del hemo, porfirias e hiperbilirrubinemia 1. Síntesis de hemo 2. Enfermedades asociadas con la síntesis del hemo 3. Degradación de hemo a bilirrubina 4. Pruebas de laboratorio: bilirrubina directa, total e indirecta 5. Problemas con la degradación del hemo Resumen Capítulo 15: Metabolismo del hierro: anemia ferropénica y sobrecarga de hierro 1. Principales depósitos de hierro del organismo 2. Absorción del hierro de la dieta 3. Regulación de la liberación de hierro a la circulación

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4. Transporte del hierro en sangre 5. Hierro en la mitocondria 6. Flujo diario de hierro 7. Interpretación de las pruebas de laboratorio relativas al hierro 8. Déficit de hierro 9. Sobrecarga de hierro Resumen Capítulo 16: Eritropoyesis, función de la hemoglobina y hemograma completo 1. Eritropoyesis 2. Composición proteica de la hemoglobina 3. Unión de oxígeno por la hemoglobina y la mioglobina 4. Función de transporte y tamponamiento del CO2 y el HCO3− en sangre 5. Monoxihemoglobina de carbono y metahemoglobina 6. Datos de laboratorio clínicamente importantes sobre los glóbulos rojos 7. Color de las hemoglobinas Resumen Capítulo 17: Hemoglobinopatías 1. Relación entre el paludismo y algunas hemoglobinopatías 2. Talasemias 3. Anemia drepanocítica y hemoglobina S 4. Enfermedad por hemoglobina C, hemoglobina SC y hemoglobina E 5. Resumen de las causas y manifestaciones de las hemoglobinopatías más comunes

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6. Análisis de hemoglobina para el diagnóstico de las hemoglobinopatías Resumen Capítulo 18: Transporte de hidratos de carbono, malabsorción de hidratos de carbono e intolerancia a la lactosa 1. Clasificación de los hidratos de carbono 2. Digestión de polisacáridos y disacáridos en el intestino delgado 3. Transporte de monosacáridos 4. Metabolismo bacteriano de los hidratos de carbono no digeridos que llegan al colon 5. Malabsorción de hidratos de carbono 6. Inhibidores de SGLT: fármacos que inhiben el transporte de glucosa dependiente de Na+ Resumen Capítulo 19: La glucólisis y su regulación por hormonas e hipoxia 1. Reacciones químicas de la glucólisis 2. Glucólisis aeróbica frente a anaeróbica 3. Mecanismos básicos en la regulación de la glucólisis 4. Interacciones de la glucólisis con otras vías 5. Regulación de la glucólisis específica de tejido 6. Métodos de laboratorio y pruebas complementarias comunes 7. Enfermedades causantes de un flujo anormal en la glucólisis Resumen Capítulo 20: Metabolismo de la fructosa y la galactosa: Intolerancia hereditaria a la fructosa y galactosemia 1. Metabolismo normal de la fructosa

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2. Vía del poliol y su papel en la enfermedad 3. Absorción y metabolismo anormal de la fructosa 4. Metabolismo normal de la galactosa 5. Galactosemia 6. Síntesis de lactosa en la mama lactante Resumen Capítulo 21: Ruta de las pentosas fosfato, estrés oxidativo y deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 1. Pasos de la vía de las pentosas fosfato 2. Procesos intracelulares que usan NADPH 3. Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa Resumen Capítulo 22: Ciclo del ácido cítrico y deficiencia de tiamina 1. Las mitocondrias convierten el piruvato en acetil-CoA 2. Reacciones del ciclo del ácido cítrico 3. El oxalacetato ayuda a reponer los intermediarios del ciclo del ácido cítrico 4. Regulación del ciclo del ácido cítrico y el uso de piruvato 5. Problemas asociados con el ciclo del ácido cítrico Resumen Capítulo 23: Fosforilación oxidativa y enfermedades mitocondriales 1. Fosforilación oxidativa 2. Interrelación de la glucólisis, el ciclo del ácido cítrico y la fosforilación oxidativa 3. El ADN mitocondrial y su herencia

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4. Enfermedades que afectan a las mitocondrias Resumen Capítulo 24: Metabolismo del glucógeno y glucogenosis 1. Síntesis de glucógeno (glucogénesis) 2. Degradación del glucógeno (glucogenólisis) 3. Trastornos del metabolismo del glucógeno Resumen Capítulo 25: Gluconeogénesis e hipoglucemia en ayunas 1. Vía de la gluconeogénesis 2. Orígenes de los sustratos y la energía para la gluconeogénesis 3. Regulación de la gluconeogénesis 4. Enfermedades asociadas a un ritmo anómalo de la gluconeogénesis Resumen Capítulo 26: Insulina y hormonas contrarreguladoras 1. Estructura del páncreas humano 2. Síntesis de glucagón, péptidos similares al glucagón, insulina, adrenalina y cortisol 3. Secreción de glucagón, péptidos similares al glucagón, insulina, adrenalina y cortisol 4. Efectos de la insulina y las hormonas contrarreguladoras sobre los tejidos 5. Efectos fisiológicos y cambios patológicos en la sensibilidad a la insulina 6. Patología de la secreción de insulina y de las hormonas contrarreguladoras Resumen

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Capítulo 27: Ácidos grasos, cuerpos cetónicos y cetoacidosis 1. Uso y nomenclatura de los ácidos grasos 2. Síntesis de ácidos grasos 3. Activación, elongación y desaturación de los ácidos grasos 4. Oxidación de los ácidos grasos 5. Síntesis y degradación de los cuerpos cetónicos 6. Visión general del uso de los combustibles en los tejidos 7. Trastornos metabólicos del metabolismo de ácidos grasos y cuerpos cetónicos Resumen Capítulo 28: Triglicéridos e hipertrigliceridemia 1. Estructura y función de los triglicéridos 2. Digestión de los triglicéridos y absorción de los ácidos grasos y los monoglicéridos 3. Producción y exportación de los triglicéridos del intestino, del hígado y de las glándulas mamarias 4. Hidrólisis de los triglicéridos de los quilomicrones y las partículas VLDL y depósito de los triglicéridos en los adipocitos 5. Hidrólisis de los triglicéridos almacenados 6. Determinaciones de laboratorio 7. Absorción, transporte y almacenamiento de las vitaminas liposolubles A, D, E y K 8. Trastornos del metabolismo de los triglicéridos Resumen Capítulo 29: Metabolismo del colesterol e hipercolesterolemia 1. Absorción del colesterol

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2. Síntesis de colesterol de novo 3. Transporte de colesterol a través de la sangre 4. Metabolismo de la bilis 5. Hipercolesterolemia 6. Hiperlipemia combinada Resumen Capítulo 30: Metabolismo del etanol y consecuencias del síndrome de dependencia del alcohol 1. Efectos del consumo de alcohol sobre la salud pública 2. Metabolismo del etanol 3. Efecto agudo del etanol sobre las vías metabólicas 4. Efectos de la ingesta crónica de alcohol sobre el funcionamiento de los órganos Resumen Capítulo 31: Hormonas esteroideas y vitamina D 1. Propiedades generales y síntesis de las hormonas esteroideas 2. Esteroides sexuales 3. Glucocorticoides 4. Mineralocorticoides 5. Vitamina D Resumen Capítulo 32: Eicosanoides 1. Familias de eicosanoides 2. Prostaglandinas y tromboxanos

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3. Leucotrienos y lipoxinas Resumen Capítulo 33: Señalización 1. Principios de la señalización 2. Señalización mediante receptores acoplados a proteínas G 3. Receptores de factores de crecimiento que son receptores tirosina cinasas Resumen Capítulo 34: Digestión de las proteínas de la dieta y síntesis neta de proteínas corporales 1. Digestión de las proteínas en el estómago 2. Digestión de las proteínas en el intestino 3. Transporte de aminoácidos y péptidos pequeños 4. Síntesis de proteínas corporales Resumen Capítulo 35: Degradación de las proteínas, metabolismo de los aminoácidos y balance nitrogenado 1. Degradación de las proteínas corporales 2. Eliminación del nitrógeno de los aminoácidos 3. Deficiencias en la eliminación de nitrógeno 4. Resumen del metabolismo de los aminoácidos 5. Balance nitrogenado Resumen Capítulo 36: Metabolismo de un carbono, deficiencias de folatos y de cobalamina

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1. Fuentes y absorción de los folatos de la dieta 2. Carga de los tetrahidrofolatos con grupos de un carbono 3. Uso de los grupos de un carbono en los tetrahidrofolatos 4. El ciclo de los grupos metilo activados 5. Absorción de cobalamina 6. Enzimas que utilizan cobalamina como cofactor 7. Anemia megaloblástica debida a deficiencia de folato o de cobalamina 8. Otras enfermedades asociadas a los folatos 9. Vía de la transulfuración y metabolismo de la cisteína Resumen Capítulo 37: Nucleótidos de pirimidina y quimioterapia 1. Síntesis de novo de uridina monofosfato, un precursor de todos los nucleótidos de pirimidina 2. Síntesis y usos de UTP y CTP 3. Reducción de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos 4. Síntesis de dTMP 5. Fármacos quimioterápicos que interfieren con la síntesis de dTMP 6. Degradación de los nucleótidos de pirimidina Resumen Capítulo 38: Gota y otras enfermedades relacionadas con el metabolismo de los nucleótidos de purina 1. Síntesis de novo de los nucleótidos de purina 2. Degradación y recuperación de los nucleótidos de purina 3. Hiperuricemia 4. Gota

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5. Tiopurinas Resumen Capítulo 39: Diabetes 1. Visión general de la clasificación de la diabetes 2. Metabolismo durante la deficiencia grave de insulina 3. Diagnóstico de la diabetes 4. Patogenia, diagnóstico y tratamiento de la diabetes tipo 1 5. Patogenia, diagnóstico y tratamiento de la diabetes tipo 2 6. MODY 7. Diabetes gestacional 8. Complicaciones de la diabetes Resumen Índice alfabético

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Página de créditos

Avda. Josep Tarradellas, 20-30, 1.°, 08029, Barcelona, España Netter’s Essential Biochemistry Copyright © 2018 by Elsevier Inc. All rights reserved. ISBN: 978-1-929007-63-9 This translation of Netter’s Essential Biochemistry, by Peter Ronner, was undertaken by Elsevier España, S.L.U. and is published by arrangement with Elsevier, Inc. Esta traducción de Netter’s Essential Biochemistry, de Peter Ronner, ha sido llevada a cabo por Elsevier España, S.L.U. y se publica con el permiso de Elsevier, Inc. Netter. Bioquímica esencial, de Peter Ronner © 2020 Elsevier España, S.L.U. ISBN: 978-84-9113-515-9 eISBN: 978-84-9113-636-1 Todos los derechos reservados. Reserva de derechos de libros Cualquier forma de reproducción, distribución, comunicación pública o transformación de esta obra solo puede ser realizada con la autorización de sus titulares, salvo excepción prevista por la ley. Diríjase a CEDRO (Centro Español de Derechos Reprográficos) si necesita fotocopiar o escanear algún fragmento de esta obra (www.conlicencia.com; 91 702 19 70/93 272 04 45).

Adve r te ncia Esta traducción ha sido llevada a cabo por Elsevier España, S.L.U. bajo su única responsabilidad. Facultativos e investigadores deben siempre

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contrastar con su propia experiencia y conocimientos el uso de cualquier información, método, compuesto o experimento descrito aquí. Los rápidos avances en medicina requieren que los diagnósticos y las dosis de fármacos recomendadas sean siempre verificados personalmente por el facultativo. Con todo el alcance de la ley, ni Elsevier, ni los autores, los editores o los colaboradores asumen responsabilidad alguna por la traducción ni por los daños que pudieran ocasionarse a personas o propiedades por el uso de productos defectuosos o negligencia, o como consecuencia de la aplicación de métodos, productos, instrucciones o ideas contenidos en esta obra. Revisión científica: Dra. María Josefa Sabriá Pau Profesora Titular de Bioquímica Facultad de Medicina. Universidad Autónoma de Barcelona Servicios editoriales: DRK Edición Depósito legal: B 18460-2019 Impreso en España

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Dedicatoria A Wanda y Lukas

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Sobre el autor

Peter Ronner, PhD, es profesor de Bioquímica y Biología Molecular en el Sidney Kimmel College of Medicine de la Thomas Jefferson University de Filadelfia. Tiene un nombramiento secundario como Professor of Pharmaceutical Sciences en el College of Pharmacy de la Thomas Jefferson University. El Dr. Ronner se doctoró en bioquímica en el Swiss Federal Institute of Technology (ETH) de Zúrich. En sus investigaciones de laboratorio previas se dedicó a estudiar la secreción de hormonas pancreáticas. El Dr. Ronner ha enseñado a estudiantes de Medicina durante casi 30 años y a estudiantes de Farmacia durante casi 10 años. También fue presidente de la Association of Biochemistry Course Directors (actual Association of Biochemistry Educators). En Jefferson ha recibido numerosos

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galardones por su docencia, incluido un premio Lindback y un retrato.

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Agradecimientos Muchas personas me han ayudado a escribir este libro, pero el Dr. John Thomas, de la New York University School of Medicine merece una mención destacada. Él y yo trabajamos juntos en este libro hasta que nos vimos obligados a realizar una pausa durante unos años. Unos años antes, en la University of Pennsylvania, la difunta Dra. Annemarie Weber me introdujo en la docencia de la bioquímica a estudiantes de Medicina. Ella era un magnífico modelo a seguir. En la Thomas Jefferson University, el Dr. Darwin Prockop me dio la idea de escribir un libro de bioquímica. Muchos años después, Paul Kelly (que entonces estaba en Icon Learning Systems) me comentó la idea de utilizar las imágenes del Dr. Netter para un libro de repaso de bioquímica. Eso me gustó, porque la bioquímica se enseña como una ciencia bastante abstracta que a los estudiantes les resulta difícil de relacionar con los pacientes reales. Yo pensé que las imágenes de Netter proporcionarían la perspectiva del médico clínico. Gracias al apoyo de mi director, el Dr. Jeffrey Benovic, el proyecto de este libro se convirtió en parte de mis objetivos académicos. Estoy agradecido por los inestimables comentarios que los numerosos estudiantes de Medicina y Farmacia de Jefferson me han realizado a lo largo de los años. Quisiera expresar mi agradecimiento al equipo de Elsevier por su apoyo, sobre todo a Elyse O’Grady (Senior Content Strategist), Stacy Eastman y Marybeth Thiel (Content Development Specialists), así como a Carrie Stetz (Senior Project Manager/Specialist). Por último, quiero agradecer a mi familia y amigos su apoyo durante la redacción de esta obra. Este libro está dedicado a mi mujer Wanda y a mi hijo Lukas. Wanda ha sido una influencia clave para mí, porque me ha proporcionado constantemente su perspectiva como médico clínico y como docente de estudiantes de Medicina. Lukas, estudiante de Medicina especializado en bioquímica, ha sido mi consejero de máxima confianza en todo lo relacionado con estudiantes jóvenes, química e ilustraciones, además de haber revisado gran parte de mis textos.

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Coautores y revisores de capítulo Estoy profundamente agradecido a John Thomas por sus contribuciones, en el diseño de este libro y en la escritura de los borradores de varios capítulos: «Pruebas clínicas basadas en el ADN o el ARN»; «Genética básica para bioquímica»; «Transcripción y procesado del ARN»; «Traducción y procesado postraduccional de las proteínas»; «Ruta de las pentosas fosfato, estrés oxidativo y deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa»; «Fosforilación oxidativa y enfermedades mitocondriales»; «Ácidos grasos, cuerpos cetónicos y cetoacidosis»; «Triglicéridos e hipertrigliceridemia»; «Metabolismo del colesterol e hipercolesterolemia»; «Hormonas esteroideas y vitamina D»; «Eicosanoides»; y «Señalización». John Thomas, PhD, Research Associate Professor (jubilado) Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology New York University School of Medicine New York, New York Estoy muy agradecido a Emine Ercikan Abali por ser la coautora de los capítulos sobre «Triglicéridos e hipertrigliceridemia» y «Metabolismo del colesterol e hipercolesterolemia». Emine Ercikan Abali, PhD, Associate Professor of Biochemistry and Molecular Biology Rutgers Robert Wood Johnson Medical School Piscataway, New Jersey Estoy muy agradecido a las siguientes personas por haber contribuido con su experiencia y por su labor como revisores de capítulo: David Axelrod, MD, Associate Professor of Medicine Department of Medicine Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Samir K. Ballas, MD, Emeritus Professor of Medicine and Pediatrics Cardeza Foundation for Hematologic Research Department of Medicine, Division of Hematology Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania James C. Barton, MD, Medical Director Southern Iron Disorders Center; Clinical Professor of Medicine Department of Medicine

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University of Alabama at Birmingham Birmingham, Alabama Jeffrey L. Benovic, PhD, Professor Department of Biochemistry and Molecular Biology Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Bruno Calabretta, MD, PhD, Professor Department of Cancer Biology Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Gino Cingolani, PhD, Professor Department of Biochemistry and Molecular Biology Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Joe Deweese, PhD, Associate Professor Department of Pharmaceutical Sciences Lipscomb University, College of Pharmacy and Health Sciences Nashville, Tennessee Tina Bocker Edmonston, MD, Associate Professor Department of Pathology and Laboratory Medicine Cooper University Health Care, Cooper Medical School at Rowan University Camden, New Jersey Steven Ellis, PhD, Professor Department of Biochemistry University of Louisville Louisville, Kentucky Masumi Eto, PhD, Associate Professor Department of Molecular Physiology and Biophysics Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Andrzej Fertala, PhD, Professor Department of Orthopaedic Surgery Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Elizabeth Gilje, BS, Medical Student Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania

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Christopher Haines, MD, Assistant Professor Department of Family and Community Medicine Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Steven K. Herrine, MD, Professor Department of Medicine Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Jacqueline M. Hibbert, PhD, Associate Professor Department of Microbiology, Biochemistry and Immunology Morehouse School of Medicine Atlanta, Georgia Jan B. Hoek, PhD, Professor Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Tanis Hogg, PhD, Associate Professor Department of Medical Education Texas Tech University Health Sciences Center El Paso, Paul L. Foster School of Medicine El Paso, Texas Ya-Ming Hou, PhD, Professor Department of Biochemistry and Molecular Biology Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Serge A. Jabbour, DM, Professor Department of Medicine Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Francis E. Jenney, Jr, PhD, Associate Professor Department of Biomedical Sciences Georgia Campus–PCOM Suwanee, Georgia Erica Johnson, PhD, Genomics Program Manager Clinical Laboratories Thomas Jefferson University Hospital Philadelphia, Pennsylvania Leo C. Katz, MD,

Clinical Associate Professor

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Department of Medicine, Division of Gastroenterology and Hepatology Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Janet Lindsley, PhD, Associate Professor Department of Biochemistry University of Utah, School of Medicine Salt Lake City, Utah Diane Merry, PhD, Professor Department of Biochemistry and Molecular Biology Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Michael Natter, BA, Medical Student Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania John M. Pascal, PhD, Associate Professor Department of Biochemistry and Molecular Medicine University of Montreal Montreal, Québec, Canada Puttur D. Prasad, PhD, Professor Department of Biochemistry and Molecular Biology Medical College of Georgia at Augusta University Augusta, Georgia Lawrence Prochaska, PhD, Professor Department of Biochemistry and Molecular Biology Wright State University, Boonshoft School of Medicine Dayton, Ohio Lucy C. Robinson, PhD, Associate Professor Department of Biochemistry and Molecular Biology Louisiana State University Health Sciences Center Shreveport, Louisiana Lukas Ronner, BS, Medical Student Icahn School of Medicine at Mount Sinai New York, New York Wanda Ronner, MD, Professor of Clinical Obstetrics and Gynecology Department of Obstetrics and Gynecology Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania Philadelphia, Pennsylvania

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Richard Sabina, PhD, Professor (jubilado) Department of Biomedical Sciences Oakland University William Beaumont School of Medicine Rochester, Minnesota John Sands, PhD, Professor Department of Biochemistry Ross University, School of Medicine Picard, Dominica Charles Scott, PhD, Director, Jefferson Discovery Core Department of Biochemistry and Molecular Biology Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Philip Wedegaertner, PhD, Professor Department of Biochemistry and Molecular Biology Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Charlene Williams, PhD, Professor Department of Biomedical Sciences Cooper Medical School of Rowan University Camden, New Jersey Edward Winter, PhD, Professor Department of Biochemistry and Molecular Biology Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University Philadelphia, Pennsylvania Takashi Yonetani, PhD, Professor Department of Biochemistry and Biophysics Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania Philadelphia, Pennsylvania

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Sobre el artista Frank H. Netter, MD Frank H. Netter nació en la ciudad de Nueva York en 1906. Estudió arte en la Art Students’ League y en la National Academy of Design antes de entrar en la Facultad de Medicina de la New York University, donde se licenció en Medicina en 1931. Durante sus años de estudiante, los esquemas de los apuntes del Dr. Netter atrajeron la atención de los profesores de la facultad y de otros médicos, lo cual le permitió aumentar sus ingresos ilustrando artículos y libros de texto. Después de establecer una clínica quirúrgica en 1933, continuó dibujando como actividad paralela, pero finalmente optó por dejar la práctica de la cirugía y dedicarse al arte a tiempo completo. Tras servir en el ejército estadounidense durante la Segunda Guerra Mundial, el Dr. Netter empezó su larga colaboración con la compañía farmacéutica CIBA (actualmente Novartis Pharmaceuticals). Esta asociación duró 45 años y dio como resultado una extraordinaria colección de ilustraciones bien conocidas por los médicos y otros profesionales de la salud del mundo entero. En 2005, Elsevier Inc. compró 1a Colección Netter y todas las publicaciones de Icon Learning Systems. Existen actualmente más de 50 publicaciones de Elsevier Inc. en las que figuran ilustraciones del Dr. Netter disponibles a través de Elsevier Inc. (en EE.UU.: www.us.elsevierhealth.com/Netter; en el resto del mundo: www.elsevierhealth.com). Los trabajos del Dr. Netter se encuentran entre los más bellos ejemplos del uso de la ilustración en la enseñanza de los conceptos médicos. Los 13 libros de la Colección Netter de ilustraciones médicas, que incluyen la mayor parte de los más de 20.000 dibujos realizados por el Dr. Netter, fueron y siguen siendo uno de los trabajos médicos más famosos hasta ahora publicados. Su Atlas de Anatomía Humana, publicado por primera vez en 1989, muestra los dibujos anatómicos de la Colección Netter. Traducido a 16 idiomas, es el atlas de anatomía de elección entre los estudiantes de Medicina y de otras profesiones sanitarias de todo el mundo. Estas ilustraciones son apreciadas no solo por sus cualidades estéticas sino también por su contenido intelectual. Como escribió el Dr. Netter en 1949, «... la clarificación de un tema constituye el objetivo y la finalidad de la ilustración. No importa la belleza de la pintura, ni cuán delicada y sutil sea la representación del tema, ya que tendrá poco valor como ilustración médica si no sirve para esclarecer un determinado concepto». El planteamiento, la concepción, el punto de vista y el enfoque del Dr. Netter son lo que da coherencia a sus dibujos y lo que los hace tan valiosos intelectualmente.

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Frank H. Netter, MD, médico y artista, falleció en 1991. Conozca más sobre el médico-artista cuyo trabajo ha inspirado la colección Netter Reference en: http://www.netterimages.com/artist/netter.htm.

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Prefacio Este libro ofrece una introducción y una revisión de la bioquímica, ya que es una de las competencias requeridas para el grado en Medicina o Farmacia. Cada vez es más frecuente que las ciencias básicas se enseñen junto con la ciencia clínica, a menudo órgano a órgano. Este libro puede ayudar a los estudiantes de estos planes de estudios integrados a comprender de forma específica la bioquímica, en particular el metabolismo. Está estructurado de modo que sea útil tanto para los principiantes como para los estudiantes que necesiten una revisión rápida a la hora de preparar los exámenes de licenciatura. Los capítulos tienen numerosas referencias cruzadas, de modo que el material pueda utilizarse casi en cualquier secuencia de capítulos. Las descripciones de los estados patológicos son una parte constante del libro en lugar de una adición al margen. Los estudiantes suelen encontrar dificultades a la hora de utilizar sus conocimientos de ciencias básicas para resolver problemas clínicos. Por fortuna, las imágenes del Dr. Netter («el Miguel Ángel de la medicina»), así como el texto y otros diagramas de este libro, les ayudarán a relacionar la ciencia básica con la práctica clínica. La estructura de los capítulos facilita que el lector decida lo que quiere leer y revisar. ■ La Sinopsis es una panorámica introductoria del contenido del capítulo y requiere muy pocos conocimientos previos. ■ Los Objetivos de aprendizaje indican lo que el lector debería ser capaz de hacer cuando domine el material presentado en el capítulo. ■ Cada sección comienza con una pequeña introducción. ■ Los términos seleccionados están impresos en negrita para que sea más fácil encontrar el texto relevante partiendo del índice. ■ Los diagramas contienen solo la información más esencial. ■ El Resumen proporciona una panorámica breve del material del capítulo. ■ La sección de Lecturas recomendadas proporciona al lector un punto de partida para satisfacer intereses más profundos. Escribir este libro y diseñar los gráficos asociados ha sido un viaje maravilloso e interesante. También he disfrutado durante muchos años de la docencia de la bioquímica a futuros médicos y farmacéuticos. Espero que los lectores también se sorprendan por los procesos que subyacen a la existencia humana, tanto en la salud como en la enfermedad.

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Peter Ronner P.S.: Los lectores pueden enviar sus sugerencias de mejoras a [email protected].

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CAPÍTULO 1

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El cariotipo humano y la estructura del ADN Sinopsis ■ La información hereditaria está codificada en el ácido desoxirribonucleico (ADN). El ADN es un polímero lineal de desoxirribonucleótidos y está presente en el núcleo y las mitocondrias de las células. ■ El ADN está formado por pares de moléculas complementarias; cada par asume una estructura de doble hélice. ■ Las dobles hélices de ADN del núcleo están enrolladas para formar estructuras de orden superior. La más sencilla de estas estructuras es el nucleosoma; las estructuras más complejas están en forma de cromosomas condensados durante la división celular. El estudio con microscopia óptica de estos cromosomas forma parte de la determinación del cariotipo. ■ Las helicasas y topoisomerasas modifican el enrollamiento del ADN para la transcripción, replicación y reparación del ADN. ■ Se pueden utilizar inhibidores de las ADN topoisomerasas para destruir células cancerosas y bacterias.

Objetivos de aprendizaje Para dominar este tema, debería ser capaz de hacer lo siguiente: ■ Describir los componentes y la arquitectura de una doble hélice de ADN y explicar dónde se unen las proteínas a las hélices de ADN. ■ Presentar un ejemplo de descripción de una secuencia de ADN en el estilo abreviado habitual. ■ Describir la unidad más básica de empaquetado del ADN en el núcleo. ■ Describir el cariotipo humano normal e indicar el número de dobles hélices de ADN que componen un único cromosoma en metafase. ■ Describir la función de las ADN topoisomerasas y explicar el papel de estas enzimas en la modificación de la topología de los cromosomas.

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1. Estructura química del ADN Las mitocondrias y el núcleo de cada célula contienen ADN, que es un polímero de cuatro tipos básicos de nucleótidos. El ADN almacena la información hereditaria por medio de su secuencia de nucleótidos. El ADN es un polímero lineal de los desoxirribonucleótidos desoxiadenosina monofosfato (dAMP), desoxiguanosina monofosfato (dGMP), desoxicitidina monofosfato (dCMP) y timidina monofosfato (dTMP, TMP; fig. 1.1). Cada desoxirribonucleótido está formado por desoxirribosa fosfato (derivada de una pentosa, un azúcar de 5 átomos de carbono) unida covalentemente a una base que es adenina, guanina, citosina (o 5metilcitosina) o timina. Desde el punto de vista estructural, la adenina y la guanina son similares a la purina; por ello se las llama nucleótidos purínicos (la síntesis, el recambio y la degradación de estos nucleótidos se describen en el cap. 38). Estructuralmente, la citosina y la timina son similares a la pirimidina, por lo cual se las llama nucleótidos pirimidínicos (la síntesis de estos nucleótidos se describe en el cap. 37).

FIG. 1.1

Estructura de los desoxirribonucleótidos que se encuentran en el ADN. El asterisco indica el lugar de la posible metilación de la citosina.

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Como parte de la regulación epigenética, ∼4% de los nucleótidos de citidina del ADN del núcleo están metilados a 5-metildesoxicitidina (v. fig. 1.1). El término regulación epigenética se refiere a los cambios en el ADN o en las proteínas asociadas al ADN que no afectan a la secuencia de las bases, pero que sí afectan a la expresión génica. Algunos de estos cambios pueden ser hereditarios y transmitirse de una célula a sus descendientes (v. impronta genómica en el cap. 5). En un sentido bastante general, la metilación influye en el empaquetado de orden superior y la transcripción del ADN (v. cap. 6). La metilación es necesaria para la inactivación del segundo cromosoma X en las mujeres (v. caps. 5 y 21), el silenciado de determinados transposones (elementos genéticos móviles), la regulación de la expresión de los genes durante el desarrollo y la determinación de la expresión de determinados genes procedentes solo de la madre o solo del padre. Cada molécula de ADN tiene un extremo 5′ y un extremo 3′ (fig. 1.2). Para distinguir los átomos de la desoxirribosa de los de la base, a los átomos de carbono de la desoxirribosa se les asigna un apóstrofo (prima) como posfijo (p. ej., 3′). El dinucleótido que se muestra en la figura 1.2 tiene un grupo fosfato en la posición 5′ del nucleótido 1 y un grupo hidroxilo en la posición 3′ del nucleótido 2, lo cual es típico del ADN. Los nucleótidos están unidos por enlaces fosfodiéster. El ADN se alarga normalmente en el extremo 3′ (v. sección 1 del cap. 3).

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FIG. 1.2

Estructura y polaridad de una única cadena de ADN.

Por convención, la secuencia del ADN se escribe como la secuencia de las bases en dirección 5′→3′, utilizando A para adenina, C para citosina, G para guanina y T para timina. Si la secuencia se escribe en dirección 3′→5′, se debe indicar. La secuencia de bases del ADN contiene información hereditaria. El ADN se encuentra en el núcleo (v. sección 4) y en las mitocondrias (v. sección 3 del cap. 23).

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2. Enlaces de hidrógeno entre bases complementarias De manera similar a una cremallera, las moléculas de ADN complementarias se asocian mediante enlaces de hidrógeno. A y T se pueden unir con dos enlaces de hidrógeno, y C y G con tres enlaces de hidrógeno. En el emparejamiento de bases propuesto por Watson y Crick, A y T están unidas entre sí por enlaces de hidrógeno, de la misma manera que C y G. La base de cada nucleótido contiene uno o más donantes de hidrógeno (–OH y – NH2) y uno o más aceptadores de hidrógeno (=O y =N–). Un aceptador de hidrógeno puede formar un enlace parcial con el átomo de hidrógeno de un donante; este enlace se denomina enlace de hidrógeno. A y T contienen cada una un donante de hidrógeno y un aceptador de hidrógeno en las posiciones adecuadas, de modo que A y T se pueden unir por un total de dos enlaces de hidrógeno (fig. 1.3). C tiene un donante de hidrógeno y dos aceptadores de hidrógeno, mientras que G tiene dos donantes de hidrógeno y un aceptador de hidrógeno en las posiciones adecuadas, de manera que C y G pueden estar unidas por un total de tres enlaces de hidrógeno. Como forman enlaces de hidrógeno la una con la otra, A y T se denominan bases complementarias; también C y G son bases complementarias. Los pares de bases CG son más difíciles de separar que los pares de bases AT porque tienen más enlaces de hidrógeno. (El emparejamiento de bases distinto al modelo propuesto por Watson y Crick se observa predominantemente en el ácido ribonucleico [ARN], en el que es frecuente.)

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FIG. 1.3

Enlaces de hidrógeno entre bases complementarias.

En dos moléculas de ADN complementarias, todas las bases forman pares de bases AT y GC unidas por enlaces de hidrógeno, y las moléculas están emparejadas en sentido antiparalelo. Por ejemplo, las moléculas 5′-AACGT-3′ y 3′-TTGCA-5′ son complementarias (fig. 1.4). Así, el nucleótido del extremo 5′ de una cadena de ADN está unido por enlaces de hidrógeno al nucleótido del extremo 3′ de la cadena de ADN complementaria. Todo el ADN humano hereditario está en forma de cadenas complementarias que in vivo habitualmente adoptan una estructura de doble hélice (fig. 1.5). En las mitocondrias, cada cadena de ADN está formada por aproximadamente 16.000 nucleótidos; en el núcleo, cada cadena de ADN está formada por más de 45 millones de nucleótidos.

FIG. 1.4 Estructura básica del ADN bicatenario. El ADN bicatenario puede formar una doble hélice (v. fig. 1.5).

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FIG. 1.5 Estructura de doble hélice del ADN. Se muestra la estructura de un segmento de 11 pares de bases del gen N-ras humano (la secuencia de la cadena morada es 5′-GGCAGGTGGTG; esta secuencia frecuentemente experimenta mutaciones, lo que favorece la aparición de tumores). Las bases están en el centro, y las ribosas están situadas en la periferia de la hélice. Los cilindros serpenteantes azul y morado son las formas imaginarias que conectan los átomos de fósforo y muestran el avance de la hélice. Los enlaces que conectan los fosfatos y las ribosas, y que constituyen el verdadero esqueleto de la cadena de ADN, generalmente están situados inmediatamente fuera de los cilindros calculados. Los planos de los anillos de las desoxirribosas y las bases se muestran en gris claro. Las dos cadenas de ADN son antiparalelas; la cadena azul se enrolla hacia abajo (de 5′ a 3′), mientras que la cadena morada se enrolla en su trayecto hacia arriba (de 5′ a 3′). La estructura de este oligómero recuerda sobre todo a la estructura del ADN B. (Basado en el archivo de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 1AFZ de Zegar IS, Stone MP. Solution structure of an oligodeoxynucleotide containing the human N-ras codon 12 sequence refined from 1H NMR using molecular dynamics restrained by nuclear Overhauser effects. Chem Res Toxicol. 1996;9:114–125.)

Cuando se describe una secuencia de ADN, habitualmente se omite la secuencia de la cadena complementaria porque se puede inferir con facilidad. De acuerdo con la regla de Chargaff, el ADN contiene cantidades equimolares de A y T, así como cantidades equimolares de C y G. Los emparejamientos de bases AT y CG son el fundamento del hallazgo de Chargaff.

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3. Doble hélice de ADN La mayor parte del ADN humano adopta una estructura de doble hélice. La doble hélice está formada por dos cadenas complementarias que siguen direcciones opuestas. Las moléculas de ADN complementarias unidas entre sí por enlaces de hidrógeno normalmente adoptan la estructura de una doble hélice de ADN (v. fig. 1.5). En esta estructura, las bases unidas por enlaces de hidrógeno están próximas al eje largo central de la hélice de ADN. Los desoxirribosa fosfatos de las dos cadenas de ADN unidos covalentemente se enroscan alrededor de la periferia del cilindro de la hélice, de manera similar a la rosca de un tornillo poco habitual (un tornillo típico solo tiene una rosca). Como se pone de manifiesto en la figura 1.3, los enlaces entre las bases y las porciones de desoxirribosa (es decir, los enlaces N-glucosídicos) no se dirigen a posiciones exactamente opuestas. Por lo tanto, las dos cadenas de desoxirribosa fosfato unidas entre sí están más cerca en un lado del par de bases que en el otro lado. La consecuencia es que la doble hélice de ADN tiene surcos desiguales: un surco menor y un surco mayor. Hay varias estructuras de ADN de doble hélice que difieren en cuanto a quiralidad, diámetro y avance por vuelta. Las más importantes de estas estructuras se denominan ADN A, ADN B y ADN Z. En las células, la mayor parte del ADN está en la forma doble helicoidal similar al ADN B. Los factores de transcripción que se unen al ADN (v. cap. 6) se unen a los átomos de la superficie del surco mayor o menor y de esta forma pueden reconocer una determinada secuencia de nucleótidos. Algunos factores de transcripción incrementan aún más el contacto con el ADN, curvando o abriendo parcialmente la doble hélice. Determinadas cadenas laterales con carga positiva de las proteínas de unión al ADN, así como algunos colorantes con carga positiva utilizados en histoquímica (p. ej., los colorantes básicos hematoxilina, azul de metileno y azul de toluidina), se unen al ADN interactuando con los grupos fosfato con carga negativa. Estos grupos fosfato revisten el esqueleto del ADN y están expuestos en el exterior de la doble hélice (v. fig. 1.5). Entre las proteínas de unión al ADN se encuentran cargas positivas en algunos aminoácidos de las cadenas laterales de las histonas (v. más adelante) y de algunos factores de transcripción (v. cap. 6). Los complejos formados por el ADN y las proteínas histonas, que se unen al ADN, se denominan cromatina. Las cargas negativas de los grupos fosfatos del ADN hacen que el ADN tenga una carga total negativa, que es la base de la electroforesis del ADN (v. cap. 4). In vivo, los enlaces de hidrógeno entre las bases de las cadenas de ADN complementarias se escinden y reforman durante la replicación, reparación o transcripción del ADN (v. caps. 2, 3 y 6). In vitro, la separación y la «reunión» (hibridación) de las cadenas de ADN complementarias son una parte importante de muchas técnicas diagnósticas basadas en el ADN (v. cap. 4).

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4. Empaquetado de las dobles hélices de ADN en las cromátidas La longitud de las moléculas de ADN humanas supera con mucho el diámetro del núcleo celular. El ADN se compacta en estructuras ordenadas que van de los nucleosomas a las cromátidas en metafase. En el núcleo, el ADN se pliega para dar lugar a nucleosomas, que a su vez forman parte de órdenes de plegamiento cada vez mayores. El máximo grado de compactación del ADN es necesario para la división celular. El cromosoma humano más largo (cromosoma 1) contiene aproximadamente 246 millones de pares de bases y tiene una longitud ∼15.000 veces el diámetro de un núcleo típico. La organización del ADN también afecta a la transcripción de los genes. La unidad básica de plegamiento es el nucleosoma, del cual hay varios tipos. Los nucleosomas contienen una partícula central formada por ocho proteínas histonas, una hélice de ADN de ∼147 pares de bases, que rodea las histonas ∼1,7 veces (fig. 1.6), y ADN de unión de ∼40 pares de bases, al que a menudo se une la histona H1. Las colas N- y C-terminales de las histonas sobresalen de las partículas centrales de los nucleosomas. Se pueden modificar determinados aminoácidos de estas colas de las histonas (tabla 1.1). La consiguiente estructura de las colas de las histonas afecta al empaquetamiento, la replicación (v. cap. 3) y la transcripción del ADN (v. cap. 6).

FIG. 1.6

Empaquetamiento del ADN en el núcleo, en una partícula central llamada nucleosoma. Los nucleótidos se muestran en color negro. Se ve en marrón claro un cilindro idealizado a través de todos los átomos de fósforo. El ADN se enrolla casi dos veces alrededor de un núcleo de ocho proteínas histonas. Hay dos copias de cada una de las histonas H2A (doradas), H2B (rojas), H3 (azules) y H4 (verdes).

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(Basado en el archivo de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 1KX5 de Davey CA, Sargent DF, Luger K, Maeder AW, Richmond TJ. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 Å resolution. J Mol Biol. 2002;319:1097–1113.)

Tabla 1.1 Modificaciones de las histonas Aminoácido Modificación de la cadena lateral Lisina Metilación (mono-, di- o tri-; CH3– es un grupo metilo) Acetilación (CH3–CO– es un grupo acetilo) Ubicuitinación (la ubicuitina es una proteína de 76 residuos) Sumoilación (SUMO = small ubiquitin-like modifier, modificador pequeño similar a la ubicuitina, un grupo pequeño de proteínas de ∼100 residuos) ADP-ribosilación (conjugación con una ribosa, que a su vez forma un enlace fosfodiéster con el ADP) Arginina Metilación (mono- o di-; hay dos posibilidades para la dimetilación) Desiminación (intercambio de =NH por =O, transformando arginina en citrulina) Glutamato ADP-ribosilación Serina Fosforilación Treonina Fosforilación Tirosina Fosforilación ADP, adenosina difosfato.

Los nucleosomas se pueden organizar en fibras de cromatina de 30 nm de diámetro. Las fibras de cromatina, a su vez, se pueden condensar en estructuras de un orden aún mayor y, finalmente, en cromátidas. Las cromátidas solo se encuentran en las células en división durante la mitosis.

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5. Cambios en la topología del ADN Los procesos celulares de reparación, replicación y transcripción del ADN (que se analizan en los caps. 2, 3 y 6) precisan en ocasiones el desenrollamiento del ADN de sus estructuras (p. ej., la fibra de cromatina de 30 nm, los nucleosomas y la doble hélice), a lo que sigue de nuevo el enrollamiento. Los cambios en el enrollamiento del ADN son catalizados por helicasas y topoisomerasas. La topología es un campo de las matemáticas que describe la deformación, el giro y el estiramiento de objetos como el ADN. Como ya se ha indicado, el ADN de los cromosomas humanos se organiza en nucleosomas y estructuras de orden superior. La estructura química del ADN puede permitir solo una cantidad limitada de tensión de torsión, y la estructura de la cromatina impide la dispersión de la tensión en distancias largas. (A modo de analogía se puede considerar de qué manera el enrollamiento afecta a la forma tridimensional de un cordón de teléfono o una manguera). Por lo tanto, el enrollamiento del ADN (el estado topológico del ADN) es importante. La tensión de torsión puede deberse a la apertura parcial de una hélice de ADN (p. ej., durante la reparación, la replicación o la transcripción) o a la presencia de un complejo no rotable de enzimas que se mueve entre las dos cadenas de una doble hélice de ADN (fig. 1.7). Por ejemplo, la replicación y la transcripción producen enrollamiento excesivo, o superenrollamiento positivo, en el interior de los cromosomas.

FIG. 1.7 Tensión que se impone a la doble hélice de ADN cuando se abre parcialmente la hélice, o cuando un objeto que no puede rotar se desplaza entre las dos cadenas complementarias.

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Las helicasas pueden utilizar la energía procedente de la hidrólisis del adenosina trifosfato (ATP) para separar las dos cadenas de la doble hélice. Es necesario el aporte de energía del ATP para pagar la penalización de la rotura de los enlaces de hidrógeno entre las bases del ADN. Los seres humanos producen varias helicasas diferentes. En gran medida se desconocen las funciones fisiológicas de estas helicasas. Se sabe que mutaciones de algunas helicasas producen enfermedades: la carencia de WRN causa el síndrome de Werner (que se caracteriza predominantemente por envejecimiento prematuro); la carencia de BLM causa síndrome de Bloom (acompañado por una mayor tasa de incidencia de tumorigénesis), y la carencia de RECQ4 produce síndrome de Rothmund-Thomson (asociado a alteraciones cutáneas). Todos estos trastornos son poco habituales y se transmiten con un patrón de herencia autosómica recesiva. Una vez que se ha separado una parte de dos cadenas de ADN complementarias, las proteínas de unión al ADN monocatenario (p. ej., proteína de replicación A [RPA]) pueden prevenir el emparejamiento de las bases. Las topoisomerasas pueden aliviar la tensión del ADN y, así, alterar su topología. El ADN superenrollado es ADN que se ha plegado de nuevo sobre sí mismo para adaptarse al enrollamiento insuficiente o excesivo (superenrollamiento negativo o positivo, respectivamente) de la doble hélice. Las topoisomerasas I y II relajan el ADN superenrollado durante la replicación y la transcripción. La topoisomerasa II también desenmaraña (desencadena) el ADN para que los cromosomas se separen durante la mitosis. Las topoisomerasas tipo I cortan una cadena, mientras que las topoisomerasas tipo II cortan las dos cadenas de una doble hélice. En ambos casos, la enzima forma un enlace covalente transitorio con el extremo 5′ o 3′ del ADN roto. Las topoisomerasas tipo I (incluyendo la topoisomerasa I) alivian la tensión por torsión del ADN, cortando una cadena de la doble hélice, haciendo girar la cadena intacta o haciéndola pasar a través de la rotura y después ligando de nuevo la cadena cortada (fig. 1.8).

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FIG. 1.8

La topoisomerasa I corta una cadena de ADN y gira alrededor de la otra. Las ribosas y las bases del ADN se muestran en negro. Se ha trazado un esqueleto artificial suavizado a través de los átomos de fósforo en rojo, marrón o naranja (hay tres segmentos de ADN). La enzima se muestra en color azul verdoso. Hay un residuo de tirosina (magenta) unido covalentemente al extremo 3′ de la cadena de ADN «roja». La cadena de ADN «marrón», junto con una parte de la cadena de ADN «naranja», puede rotar y, así, alivia la tensión por rotación. Normalmente, el extremo 5′ de la cadena «marrón» reconecta después con el extremo 3′ de la cadena «roja». Aquí, el fármaco quimioterápico topotecán (se muestra como un modelo de barras con C en gris, N en azul y O en rojo) se une entre la base 3′ de la cadena «roja» y la base 5′ de la cadena «marrón»; de esta manera el topotecán impide que estas dos cadenas se vuelvan a unir entre sí, lo que lleva a la muerte celular. (Basado en el archivo de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 1K4T de Staker BL, Hjerrild K, Feese MD, Behnke CA, Burgin Jr. AB, Stewart L. The mechanism of topoisomerase I poisoning by a camptothecin analog. Proc Natl Acad Sci. 2002;99:15387-15392.)

Los inhibidores de la topoisomerasa I constituyen un método para dañar preferentemente las células tumorales, que se dividen con más frecuencia que las células normales. Los análogos de la camptotecina prolongan la vida de un complejo covalente ADN-topoisomerasa I que se forma como intermediario normal de la reacción. Conforme se copia el genoma durante la replicación (v. cap. 3), el complejo ADN–topoisomerasa I–camptotecina, que tiene un carácter obstructivo, puede generar roturas permanentes en el ADN, que la célula puede intentar reparar. Cuando el número de roturas de la doble cadena supera la capacidad de reparación de la célula (v. reparación por recombinación homóloga en el cap. 2), la célula experimenta apoptosis (es decir, muerte celular programada; v. caps. 2 y 8). Los análogos de la camptotecina (p. ej., topotecán e irinotecán) se utilizan fundamentalmente para el tratamiento de neoplasias malignas avanzadas (p. ej., cáncer pulmonar microcítico recurrente o cáncer ovárico metastásico).

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Las topoisomerasas tipo II (topoisomerasa II en seres humanos, y ADN girasa y topoisomerasa IV en bacterias) escinden las dos cadenas de la doble hélice, utilizan cambios conformacionales en las subunidades enzimáticas para hacer pasar un segmento de ADN separado entre la rotura y después ligan las cadenas cortadas (figs. 1.9 y 1.10). Para este proceso es necesario el ATP. Las topoisomerasas tipo II participan en la relajación de las superhélices que se producen por la replicación o la transcripción del ADN. Las cromátidas hermanas se entrel azan durante la replicación del ADN; esta unión se denomina encadenamiento. La función esencial de las topoisomerasas tipo II, que no pueden realizar las enzimas de tipo I, es la separación (desencadenamiento) de los cromosomas replicados antes de su compactación y de la división celular.

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FIG. 1.9

Reacción catalizada por la topoisomerasa II.

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FIG. 1.10

La topoisomerasa IIα humana cataliza el paso de una cadena de ADN a través de otra cadena de ADN. La enzima actúa en forma de dímero. La imagen muestra el dominio central catalítico, que incluye la compuerta central y la compuerta C-terminal más inferior; no se muestra el dominio ATPásico, que está en la parte superior de la estructura. (Basado en el archivo de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 4FM9 de Wendorff TJ, Schmidt BH, Heslop P, Austin CA, Berger JM. The structure of DNA-bound human topoisomerase II alpha: conformational mechanisms for coordinating inter-subunit interactions with DNA cleavage. J Mol Biol. 2012;424:109–124.)

Los inhibidores de la topoisomerasa II son útiles como fármacos antineoplásicos. La mayor parte de estos inhibidores forman parte de una clase denominada tóxicos de la topoisomerasa II. Dos fármacos de esta clase que se utilizan mucho en quimioterapia son la doxorubicina (una antraciclina) y el etopósido (una epipodofilotoxina; fig. 1.11). Cuando están presentes estos

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fármacos, la topoisomerasa II puede escindir el ADN, pero no volver a ligarlo. Por lo tanto, se inhibe la replicación y la transcripción del ADN. En consecuencia, se acumulan las roturas de las cadenas de ADN, lo que lleva a la apoptosis (muerte celular programada). Sin embargo, estos fármacos también tienen una capacidad levemente mutágena e incrementan el riesgo que tienen los pacientes de presentar leucemia relacionada con la terapia. Aparte de los tóxicos, los inhibidores catalíticos de la topoisomerasa II inhiben otras porciones del mecanismo catalítico de la enzima (p. ej., hidrólisis del ATP) y producen la muerte celular sin inducir roturas en las cadenas del ADN.

FIG. 1.11 El etopósido es un inhibidor de la topoisomerasa II y se utiliza con frecuencia para tratar el cáncer de pulmón microcítico extendido. Estos pacientes suelen tener enfermedad diseminada. El etopósido muchas veces se combina con un fármaco derivado del platino.

Algunos polifenoles de la alimentación también intoxican la topoisomerasa II. Las semillas de soja contienen genisteína, que se une a los receptores de estrógenos y puede ayudar a mejorar los síntomas de la menopausia. La genisteína también intoxica la topoisomerasa II. Parece que la genisteína tiene actividad antineoplásica, aunque en madres gestantes también confiere un mayor riesgo de leucemia infantil en la descendencia. El té verde contiene el

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polifenol galato de epigalocatequina (EGCG), que también intoxica la topoisomerasa II. No se ha establecido con detalle el efecto biológico de estos tóxicos, y hay algunos datos de que estos fármacos pueden ser quimiopreventivos. Los antibacterianos de la clase de las fluoroquinolonas inhiben la ADN girasa bacteriana (el nombre que se da a la topoisomerasa II que causa superenrollamiento positivo en las bacterias) y la topoisomerasa IV. Las quinolonas de uso habitual son los antibióticos de amplio espectro ciprofloxacino, levofloxacino, ofloxacino y moxifloxacino.

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6. El cariotipo humano El cariotipo humano está formado por 46 cromosomas. Para la cariotipificación se utilizan los cromosomas teñidos en metafase. El núcleo de cualquier célula humana normal en la fase G0 del ciclo celular (v. cap. 8) contiene 46 cromosomas (es decir, 46 dobles hélices de ADN). Como preparación para la división celular, las 46 dobles hélices se replican para formar 92 dobles hélices (v. cap. 3). Posteriormente, cada una de estas hélices se condensa mucho para dar cromátidas (v. sección 4). Las proteínas se unen a pares de cromátidas idénticas en sus centrómeros para formar cromosomas en metafase. Con colorantes basófilos (p. ej., tinción de Giemsa) se pueden ver los cromosomas en metafase con microscopia óptica (fig. 1.12). Las imágenes de los cromosomas teñidos se utilizan para caracterizar los cromosomas de un individuo (es decir, para describir su cariotipo). Los colorantes utilizados para la cariotipificación producen diversos patrones de bandas útiles con fines diagnósticos, que dependen de la técnica de tinción utilizada, el grado de compactación del ADN y la presencia de proteínas unidas al ADN.

FIG. 1.12 Cariograma masculino normal. Para la determinación del cariotipo se detienen las células cultivadas en metafase. Este cariograma muestra la imagen en microscopia óptica de los cromosomas teñidos obtenidos de una sola célula. Los cromosomas se clasifican y analizan

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según su tamaño y su patrón de bandas. (Por cortesía del Dr. Barry L. Barnoski, Oncocytogenetics Laboratory, Cooper University Hospital, Camden, NJ.)

Dos de los 46 cromosomas se denominan cromosomas sexuales; los otros 44 cromosomas son los autosomas. Los seres humanos habitualmente heredan un cromosoma sexual y 22 autosomas de cada uno de los progenitores. Hay dos tipos de cromosomas sexuales: X e Y. Cada mujer con un cariotipo normal tiene dos cromosomas X (uno de los cuales se inactiva mediante metilación; v. cap. 5). Cada hombre con un cariotipo normal tiene un cromosoma X y uno Y. Los 22 autosomas se enumeran de 1 a 22 en orden aproximadamente decreciente de tamaño (v. fig. 1.12). La separación de los cromosomas se produce durante la división celular (mitosis) y la formación de gametos (meiosis). Durante la mitosis, los pares de cromátidas se separan de manera que cada célula hija recibe 46 cromátidas (es decir, 46 dobles hélices de ADN). En células que no están en división se utiliza el término cromosoma para referirse a una única cromátida (es decir, una única doble hélice de ADN). Toda célula en la fase G0 del ciclo celular tiene 46 cromosomas (en este caso, 46 dobles hélices de ADN). Durante la meiosis I, los cromosomas homólogos forman pares que después son arrastrados hasta polos opuestos (lo que da solamente 23 cromosomas por célula, de manera que cada cromosoma contiene dos cromátidas). Durante la meiosis II, las cromátidas pareadas se separan para dar células que contienen solo 23 cromátidas (es decir, 23 dobles hélices de ADN). Las células contienen más de 100 veces más ADN en el núcleo que en las mitocondrias. Aunque la red de mitocondrias de una célula contiene miles de copias del ADN mitocondrial, incluso el más corto de los 46 cromosomas contiene más de 3.000 veces el número de pares de bases del genoma mitocondrial.

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Resumen ■ El ADN es un polímero de dAMP, dCMP, dGMP y dTMP. Las bases de estos nucleótidos pueden formar enlaces de hidrógeno para constituir los pares de bases AT o GC. Por lo tanto, A y T son bases complementarias, igual que G y C. ■ El ADN está presente fundamentalmente como dobles hélices formadas por dos cadenas de ADN complementarias. Las cadenas complementarias se emparejan en un patrón de cabeza a cola (es decir, el extremo 5′ de una cadena está emparejado con el extremo 3′ de la cadena complementaria). Salvo que se indique lo contrario, las secuencias de ADN se escriben en dirección 5′→3′. ■ Las proteínas de unión al ADN se pueden unir selectivamente a una secuencia de ADN específica mediante la interacción con los átomos de las bases que están en la superficie de los surcos de la hélice de ADN. ■ La longitud de las moléculas del ADN nuclear supera con mucho el diámetro del núcleo. En el interior del núcleo, la mayor parte del ADN se condensa para formar nucleosomas, que a su vez se condensan para dar estructuras de orden superior. Estas estructuras tienen funciones muy importantes en la regulación de la transcripción y posibilitan la separación ordenada de las moléculas de ADN durante la división celular. ■ Las helicasas separan cadenas complementarias de ADN. Las proteínas de unión al ADN monocatenario impiden el emparejamiento de cadenas separadas. Las topoisomerasas cortan una o las dos cadenas de la doble hélice de ADN, alivian la tensión por torsión (topoisomerasas I y II) o desenmarañan los cromosomas como preparación para la mitosis (topoisomerasa II) y después vuelven a ligar las cadenas. Los inhibidores de las topoisomerasas se utilizan como quimioterápicos contra el cáncer. ■ Las células humanas con un cariotipo normal contienen 46 cromosomas: 23 proceden de la madre y 23 del padre. De estos cromosomas, 44 son autosomas y dos, cromosomas sexuales.

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Lecturas recomendadas ■ Deweese JE, Osheroff MA, Osheroff N. DNA Topology and topoisomerases: teaching a “knotty” subject. Biochem Mol Biol Educ. 2008;37:2–10. ■ Ozer G, Luque A, Schlick T. The chromatin fiber: multiscale problems and approaches. Curr Opin Struct Biol. 2015;31:124–139. ■ Tessarz P, Kouzarides T. Histone core modifications regulating nucleosome structure and dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15:703–708. ■ Vos SM, Tretter EM, Schmidt BH, Berger JM. All tangled up: how cells direct, manage and exploit topoisomerase function. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011;12:827–841. ■ Wapner RJ, Martin CL, Levy B, et al. Chromosomal microarray versus karyotyping for prenatal diagnosis. N Engl J Med. 2012;367:2175–2184. ■ Zhu P, Li G. Structural insights of the nucleosome and the 30-nm chromatin fiber. Curr Opin Struct Biol. 2016;36:106–115.

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CAPÍTULO 2

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Reparación del ADN y tratamiento del cáncer Sinopsis ■ El daño del ADN se puede deber a las propiedades inherentes del ADN o a los efectos nocivos de la radiación ultravioleta, las radiaciones ionizantes, diversos fármacos o agentes nocivos del entorno. El daño se puede manifestar como lesiones en los nucleótidos, aductos de ADN, enlaces cruzados en el interior de las cadenas de ADN o entre las cadenas, o roturas de una o de las dos cadenas del ADN. Hay diversos mecanismos para reparar el ADN y garantizan que el genoma se mantenga prácticamente constante. ■ El conocimiento de la reparación del ADN es importante para entender de qué manera la reparación inadecuada del ADN lleva a la tumorigénesis, y por qué la quimioterapia y la radioterapia del cáncer pueden causar un daño muy intenso y la muerte de las células tumorales, además de producir neoplasias en células previamente normales. ■ La reparación del ADN se ha estudiado mucho en bacterias y levaduras. Aunque los seres humanos tienen vías de reparación del ADN más complejas que las de estos organismos unicelulares, las proteínas para la reparación del ADN están muy conservadas desde el punto de vista evolutivo. Como corresponde, muchas proteínas para la reparación del ADN humano reciben su nombre de sus equivalentes en las bacterias y las levaduras. ■ La vía de reparación por escisión de bases se activa cuando se altera un único nucleótido. Se elimina el nucleótido defectuoso y se reemplaza por uno nuevo que encaja en la cadena de ADN complementaria. ■ La vía para la reparación de errores de emparejamiento detecta errores de emparejamiento de pares de bases y las protrusiones debidas a ausencia o exceso de nucleótidos que se originan por una replicación defectuosa del ADN. Se elimina la porción de ADN sintetizada más recientemente y se sintetiza nuevo ADN tomando como molde la cadena de ADN complementaria. ■ La vía de reparación por escisión de nucleótidos repara daños que producen distorsiones evidentes del ADN. Estos daños pueden originarse por la exposición al sol, el humo de tabaco o los fármacos quimioterápicos derivados del platino. Se corta una sección de la cadena

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dañada y después se vuelve a sintetizar el ADN. ■ La unión de extremos no homólogos repara las roturas de la doble cadena uniendo los extremos rotos. El producto muchas veces es diferente del ADN original. Las roturas de la doble cadena pueden deberse a lesión del ADN por rayos X o fármacos quimioterápicos. ■ La vía de la recombinación homóloga repara las roturas de la doble cadena produciendo extremos protuberantes monocatenarios largos que invaden una cadena de ADN homóloga. La cadena invadida sirve a su vez como plantilla para volver a sintetizar el ADN perdido. ■ Los defectos hereditarios y adquiridos de la reparación del ADN favorecen la tumorigénesis (p. ej., en colon, mama, ovarios, páncreas y piel).

Objetivos de aprendizaje Para dominar este tema, debería ser capaz de hacer lo siguiente: ■ Resumir las principales vías para la reparación del ADN. ■ Describir los mecanismos mediante los que la luz ultravioleta y los rayos X de alta energía dañan el ADN, y cómo se reparan estos daños. ■ Describir los mecanismos por los cuales los hidrocarburos aromáticos policíclicos del humo de tabaco dañan el ADN, y cómo se reparan estos daños. ■ Explicar los mecanismos por los cuales los fármacos derivados del platino y las mostazas nitrogenadas (p. ej., ciclofosfamida) dañan el ADN, y cómo se repara este daño. ■ Describir y explicar las pruebas de laboratorio de uso habitual para detectar la reparación de los errores de emparejamiento del ADN en biopsias de tejidos. ■ Explicar el término inestabilidad de microsatélites, describir una prueba de laboratorio para detectarla y relacionar la inestabilidad de microsatélites (IMS) con una deficiencia en una vía de reparación del ADN. ■ Enumerar síndromes de cánceres hereditarios y especificar los defectos asociados en la reparación del ADN, además del patrón de herencia. Describir cualquier modificación en la quimioterapia o la radioterapia de los tumores que se deba hacer en los pacientes afectados. ■ Describir los mecanismos por los que la quimioterapia y la radioterapia destruyen las células tumorales, y por qué estos tratamientos pueden ser tumorígenos en células normales.

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1. Reparación por escisión de bases La vía de la reparación por escisión de bases (REB) corrige formas frecuentes de daño de un único nucleótido. Elimina un nucleótido alterado, añade el desoxirribonucleótido correcto y sella el corte del ADN. Aproximadamente el 1% de todos los pacientes que tienen cáncer de colon tienen dos copias defectuosas del gen MUTYH, que codifica una enzima necesaria para la REB. Todos los días, en todas las células se alteran miles de bases del ADN (fig. 2.1). Las bases (principalmente adenina y guanina) se pierden espontáneamente del esqueleto de desoxirribosa del ADN. Las bases se pueden desaminar, especialmente la 5-metilcitosina y la citosina, para dar lugar a timina y uracilo, respectivamente. Los radicales hidroxilo pueden reaccionar con las bases, especialmente con la guanina, formándose 8oxoguanina (también llamada 8-hidroxiguanina). El donante fisiológico de grupos metilo S-adenosilmetionina puede reaccionar con la adenina para formar 3-metiladenina. Las radiaciones ionizantes (p. ej., rayos X y rayos γ) pueden ionizar el agua (lo que da lugar a un radical hidroxilo), oxidar una base, escindir una base del esqueleto de desoxirribosa fosfato o fragmentar una desoxirribosa y de esta manera cortar una de las cadenas de ADN complementarias.

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FIG. 2.1

Alteraciones espontáneas del ADN que se reparan mediante la vía de reparación por escisión de bases.

En la vía de REB de parche corto, las enzimas reconocen un nucleótido

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dañado y lo sustituyen (fig. 2.2). Los seres humanos producen muchas ADN glucosilasas que se deslizan a lo largo del ADN, reconocen las bases desaminadas, hidroxiladas o metiladas, y las eliminan. Esto genera un sustrato que es reconocido por la endonucleasa AP 1, que corta el ADN en el lugar en el que falta la base. La polinucleótido cinasa/fosfatasa (PNKP) fosforila después el extremo 5′ libre y desfosforila el extremo 3′ adyacente. La poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP) se une a la rotura de la cadena y atrae la proteína XECC1, que sirve como plataforma para atraer otras proteínas de reparación. Después, la ADN polimerasa β escinde la desoxirribosa abásica y la sustituye por un nuevo nucleótido adecuado. Por último, la ADN ligasa IIIα sella el corte de la cadena de ADN para restablecer la continuidad de la molécula de ADN.

FIG. 2.2

Vía de reparación por escisión de bases de parche corto.

Un único defecto también activa la vía de REB de parche largo, que reemplaza de 2 a 10 nucleótidos consecutivos. Algunos productos de la oxidación de una desoxirribosa se deben eliminar por la vía de parche largo. Además, esta vía completa algunas de las reparaciones que no se pueden completar por la vía de REB de parche corto. Si no se repara el daño de una base, la replicación del ADN (v. cap. 3) puede insertar un nucleótido incorrecto o puede llegar a detenerse hasta que se repare la base dañada. La replicación se detiene cuando está presente la metiladenina (v. fig. 2.1), para que la vía REB pueda reemplazar la metiladenina por adenina. Cuando falta una base, la síntesis de ADN a través de la lesión inserta un nucleótido en la cadena de ADN recién sintetizada, aunque este nucleótido puede ser incorrecto. Si la replicación inserta una base incorrecta enfrente de una base dañada, la vía de reparación de errores de emparejamiento (REE) (v. sección 2) a menudo detecta el error. Por ejemplo, reconoce una A enfrente de un U (por desaminación de la C) o enfrente de una oxo-G (por hidroxilación de la guanina). La enzima ADN MYH glucosilasa, codificada por el gen MUTYH, se asocia a la vía de la REE (v. sección 2) para escindir la A situada enfrente de 8-oxoguanina (v. fig. 2.1). Después, la vía de REB sustituye la 8-oxo-G por G. MUTYH se refiere al homólogo de MutY (presente en las bacterias).

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Aproximadamente el 1% de todos los pacientes que tienen cáncer colorrectal presentan poliposis asociada a MUTYH (PAM), una enfermedad causada por defectos de la actividad de la ADN MYH glucosilasa. La enfermedad muestra una herencia autosómica recesiva. En los pacientes con PAM se acumulan las mutaciones G→T (la presencia persistente de A enfrente de 8-oxo-G hace que haya T en lugar de 8-oxo-G en la siguiente tanda de replicación). Es interesante señalar que estas mutaciones G→T se encuentran en los mismos genes que están mutados o que ya no se transcriben en algunos pacientes que tienen cáncer colorrectal esporádico (es decir, pacientes que no tienen PAM). En los pacientes con PAM, el cáncer de colon habitualmente aparece a finales de la quinta década de la vida. En ese momento, el colon suele contener de decenas a centenares de pólipos. Se están realizando ensayos clínicos de inhibidores de la PARP en pacientes que tienen tumores con defectos en la reparación por recombinación homóloga (RH) (v. sección 4) y que, en consecuencia, dependen totalmente de la REB mediada por la PARP y de la unión de extremos no homólogos (UENH; v. sección 4). Los inhibidores de la PARP bloquean la REB y la UENH porque la poli-ADP-ribosa atrae proteínas de reparación del ADN (p. ej., XRCC1) hacia las zonas dañadas del ADN. Aunque los inhibidores de la PARP son relativamente inocuos para las células normales, son especialmente tóxicos para las células tumorales que carecen de BRCA1 (cáncer de mama 1) o BRCA2, proteínas que participan en la reparación por RH.

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2. Reparación de errores de emparejamiento El sistema de reparación de errores de emparejamiento (REE) corrige emparejamientos de bases inadecuados, así como bucles de una sola cadena que se deben a inserciones o deleciones durante la replicación. La reparación actúa en la cadena de ADN sintetizada más recientemente. Hay alteraciones de la REE en ∼10-20% de los cánceres esporádicos de colon, recto, estómago o endometrio. Las mutaciones hereditarias que afectan a la REE son la causa del síndrome de Lynch, que la mayoría de las veces produce cáncer colorrectal o endometrial. La vía de la REE detecta pares de bases no complementarias y los repara. Los errores de emparejamiento se pueden deber a lo siguiente (fig. 2.3): 1) tautomerización espontánea de las bases durante la polimerización del ADN; 2) desaminación de la citosina a uracilo o de la 5-metilcitosina a timina; 3) error de inserción por la ADN polimerasa de una base que no es complementaria a la cadena de ADN que se está copiando, y 4) deslizamiento de la ADN polimerasa en las repeticiones de secuencias de nucleótidos.

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FIG. 2.3

Causas de los errores de emparejamiento de bases que se reparan por la vía de reparación de errores de emparejamiento. Las flechas azules indican los enlaces de hidrógeno para el emparejamiento de bases.

En la vía de la REE, las proteínas MSH reconocen el daño, y las proteínas MLH ayudan a iniciar la escisión del fragmento de ADN sintetizado más recientemente (fig. 2.4). Las proteínas MSH heterodiméricas (homólogas a las proteínas MutS bacterianas; tabla 2.1) detectan las bases con errores de emparejamiento y las bases no emparejadas. Después, las proteínas MLH

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(homólogas a las proteínas MutL bacterianas) se unen a las proteínas MSH. Además, las proteínas MLH se unen a una exonucleasa. La exonucleasa 1 (Exo1), anclada a las proteínas MSH y MLH, comienza la degradación de la cadena de ADN sintetizada más recientemente en un corte próximo del ADN (no está claro cómo se origina este corte). Después la ADN polimerasa δ vuelve a sintetizar la porción ausente de la cadena de ADN utilizando la cadena complementaria como plantilla. Por último, la ADN ligasa I une entre sí los fragmentos de ADN.

FIG. 2.4 Reparación de los errores de emparejamiento del ADN. Se muestra la reparación de un error de emparejamiento G–T.

Tabla 2.1 Proteínas que participan en la reparación de errores de emparejamiento del ADN en el núcleo Proteína Posibles proteínas para formar un heterodímero* absolutamente necesaria Detección del error de emparejamiento MSH2† MSH3 (para la adición o eliminación de hasta 15 nucleótidos en los microsatélites) MSH6† (para errores de emparejamiento y adición o eliminación de ≤2 nucleótidos en los microsatélites)

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Heterodímero

MutSβ MutSα

Inicio de la escisión del nucleótido MLH1† PMS1 PMS2† (se utiliza en la mayor parte de procesos de reparación de errores de emparejamiento) MLH3

MutLβ MutLα MutLγ

* Una proteína puede ser un componente parcial para otra. † La mayoría de los pacientes con síndrome de Lynch han heredado una mutación inactivadora de MSH2,

MSH6, MLH1 o PMS2.

La inactivación del sistema de REE del ADN lleva a una mayor susceptibilidad al cáncer, especialmente de colon, estómago y endometrio. Las células con una alteración en la REE acumulan mutaciones a una velocidad muy elevada. Esto lleva a mutaciones de desplazamiento del marco de lectura que modifican la producción y la función de los supresores tumorales, impiden la muerte celular programada o alteran la transducción de señales, la transcripción o la vigilancia inmunitaria. Los tumores de ∼15% de los pacientes que tienen cáncer de colon y de ∼20% de los pacientes que tienen cáncer endometrial o gástrico tienen sistemas de REE defectuosos. En los pacientes con una forma esporádica de este cáncer, el defecto de la REE habitualmente se debe a metilación del promotor de las dos copias del gen MLH1. La metilación prácticamente anula la expresión de la proteína MLH1. El síndrome de Lynch es una predisposición hereditaria al cáncer debida a una mutación en un gen de la REE del ADN en la línea germinal (fig. 2.5). Al menos 1 de cada 1.000 personas tiene síndrome de Lynch, y aproximadamente el 3% de todos los pacientes con cáncer de colon tienen síndrome de Lynch. La mayor parte de los pacientes con síndrome de Lynch han heredado una mutación que inactiva MSH2, MSH6, MLH1 o PMS2 (v. tabla 2.1). La segunda copia del gen o su promotor asociado experimentan después mutación o inactivación genética (mediante metilación del ADN) en algunas células del cuerpo, de manera que en estas células (p. ej., en el colon) no se sintetiza la proteína funcional. Los pacientes que tienen síndrome de Lynch tienen un riesgo de cáncer de colon de ∼70% a lo largo de toda la vida, de cáncer de endometrio de ∼40%, y de cáncer de estómago u ovario de ∼15%. Estos cánceres aparecen a una edad anormalmente temprana (p. ej., cáncer de colon habitualmente a mediados de la quinta década de la vida). Al contrario de los pacientes que tienen un tumor esporádico con mecanismos de REE defectuosos, los pacientes que tienen síndrome de Lynch también tienen un gen de REE mutante en los linfocitos sanguíneos. Como solo hace falta heredar un alelo defectuoso, la enfermedad muestra herencia autosómica dominante (v. cap. 5). Esto significa que, si solo está afectado un progenitor, cada uno de los miembros de la descendencia tiene una probabilidad de heredar la enfermedad del 50%.

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FIG. 2.5 Los pacientes con defectos hereditarios en la reparación de los errores de emparejamiento tienen síndrome de Lynch y tienen riesgo elevado de cáncer de colon.

La detección inmunohistoquímica de las proteínas de la REE en un tumor de colon o endometrio suele formar parte del diagnóstico de una alteración de la REE. Habitualmente se tiñe el tejido para detectar MLH1, MSH2, PMS2 y MSH6. Los pacientes que tienen cáncer de colon o endometrial esporádico por hipermetilación del promotor del gen MLH1 no muestran inmunorreactividad para MLH1. De manera similar, en los pacientes que tienen síndrome de Lynch y, en consecuencia, solo una versión mutante de una proteína de la REE particular, la inmunorreactividad para esa proteína está ausente o muy reducida. Para complicar la situación (v. tabla 2.1), la carencia de MLH1 a menudo lleva a la degradación de la proteína PMS2, y la carencia de MSH2 lleva a la pérdida de la proteína MSH6 (pero no al contrario). Los resultados de las pruebas inmunohistoquímicas se pueden

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utilizar para guiar el estudio del ADN para detectar mutaciones, hipermetilación e IMS (v. más adelante). La REE defectuosa se puede detectar en forma de IMS del ADN. Los microsatélites son repeticiones de 5 a 100 veces de secuencias que contienen de uno a cinco nucleótidos (p. ej., [A]16 o [GT]9). Los microsatélites también se denominan repeticiones en tándem pequeñas. Cuando se estudia a un paciente para detectar IMS, se obtiene ADN del tumor extirpado y a veces también de los linfocitos de la sangre periférica (se supone que el ADN de los linfocitos es representativo del ADN de la línea germinal). Mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; v. cap. 4) se amplifica el ADN que contiene determinados microsatélites (p. ej., las repeticiones de mononucleótidos BAT25 y BAT26 y las repeticiones de dinucleótidos D2S123, D5S346 y D17S250), y se analizan para determinar su tamaño. BAT26 está en el gen MSH2, pero los demás microsatélites están fuera de los genes que codifican las proteínas de la REE. En las células tumorales con carencia de REE, estas repeticiones habitualmente están acortadas, lo que da lugar a un fragmento menor de ADN cuando se amplifica mediante PCR. La mayor parte de los tumores que tienen IMS muestran longitudes anormales de cuatro o cinco de las cinco secuencias de microsatélites que se han mencionado. Habitualmente se dice que un tumor tiene una elevada IMS si dos o más de los cinco microsatélites estudiados muestran un cambio de longitud. Si solo uno de los cinco microsatélites es inestable, hay IMS baja. Si los cinco microsatélites son estables, se dice que el tumor tiene estabilidad de microsatélites. En los pacientes que tienen tumores con IMS pueden producirse cambios patogénicos en la longitud del microsatélite A26 BAT26 del gen MSH2, el microsatélite C8 del gen MSH6, el microsatélite A10 del gen del receptor 2 del factor de crecimiento tumoral β o el tracto G8 del gen de la proteína inductora de muerte celular BAX. No se sabe si las modificaciones de la longitud de las repeticiones de los otros cuatro microsatélites que se miden con fines diagnósticos (BAT25, D2S123, D5S346, D17S250) son patógenas. Los pacientes con un tumor de colon con inestabilidad de microsatélites no se benefician de la quimioterapia complementaria con 5-fluorouracilo (el mecanismo de acción del fluorouracilo se describe en el cap. 37). Por el contrario, el 5-fluorouracilo suele formar parte de la quimioterapia complementaria de los tumores de colon con microsatélites estables. Las personas que son homocigotas o heterocigotas compuestas para mutaciones en las proteínas de la REE del ADN no solo presentan cáncer gastrointestinal, sino que también tienen tumores cerebrales y neoplasias malignas hemáticas en la infancia. Este trastorno se denomina síndrome de carencia constitucional de REE (CC-REE).

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3. Reparación por escisión de nucleótidos La vía de la reparación por escisión de nucleótidos (REN) reconoce distorsiones de la doble hélice de ADN que surgen por agresiones ambientales (p. ej., luz solar o tabaquismo) o fármacos quimioterápicos (p. ej., derivados de platino). Además, repara lesiones que llevan a la detención de la transcripción. Se elimina de una vez una sección de ∼30 nucleótidos de una cadena de ADN y después se vuelve a sintetizar. La REN se puede dividir en dos partes: reparación pangenómica (PG) y reparación acoplada a la transcripción (AT). La REN-PG se realiza en todo el genoma cuando se detectan lesiones que distorsionan la hélice (p. ej., enlaces cruzados intercatenarios). Por el contrario, la REN-AT tiene lugar cuando las ARN polimerasas, que son poco eficientes en la corrección de las lesiones que desestabilizan la hélice, quedan bloqueadas en el ADN. En la REN-AT, la cadena de ADN transcrita se repara con más eficiencia que la cadena no transcrita. Parece que una red de procesos modificadores de las histonas facilita el acceso al ADN unido a las histonas. La REN-PG y la REN-AT activan el mismo conjunto de enzimas de la REN para reparar el ADN. Las distorsiones de las hélices del ADN, detectadas por la REN-PG, son un dato fundamental en muchos tipos de daño del ADN. La REN-PG corrige principalmente aductos de ADN y enlaces cruzados intracatenarios. Los aductos intracatenarios del ADN habituales incluyen las siguientes lesiones: 1) dímeros de ciclobutano como TT, AT, CT y CC producidos por la radiación ultravioleta (UV) (por el sol o por lámparas de bronceado; fig. 2.6); 2) aductos entre adenina o guanina e hidrocarburos aromáticos policíclicos (que se encuentran en el humo del cigarrillo y en contaminantes ambientales; fig. 2.7), y 3) aductos entre las secuencias GG o AG y fármacos que contienen platino (p. ej., cisplatino, carboplatino y oxaliplatino, que se utilizan en la quimioterapia de tumores sólidos; figs. 2.8 y 2.9).

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FIG. 2.6 La radiación UV induce la formación de enlaces cruzados intracatenarios de las bases pirimidínicas para dar dímeros de ciclobutano.

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FIG. 2.7

Aducto del principal metabolito del carcinógeno dibenzo[a,l]pireno con la desoxiadenosina del ADN.

FIG. 2.8

Formación de enlaces cruzados intracatenarios inducida por cisplatino entre dos bases de guanina adyacentes. A, Cisplatino. B, Aducto de cisplatino con las bases de guanina del ADN. C, Estructura en solución de un enlace cruzado intracatenario cisplatino-ADN. La platinación produce desenrollamiento parcial de la doble hélice, un ángulo anómalo de los planos de las bases de guanina y una curva global en el eje largo de la hélice. Los fármacos de platino también generan enlaces cruzados intercatenarios, que se deben reparar mediante reparación por recombinación homóloga (v. sección 4.2). (Basado en el archivo de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 1A84 de Gelasco A, Lippard SJ. NMR solution structure of a DNA dodecamer duplex containing a cis-diammineplatinum [II] d[GpG] intrastrand cross-link, the major adduct of the anticancer drug cisplatin. Biochemistry. 1998;37:9230–9239.)

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FIG. 2.9 Uso de cisplatino en el tratamiento del cáncer testicular. A los pacientes habitualmente se les realiza una orquiectomía, y suelen recibir quimioterapia complementaria con cisplatino. El tratamiento tiene éxito en parte porque las células tumorales tienen una baja capacidad de reparación por escisión de nucleótidos, y después experimentan apoptosis.

Una vez que se ha detectado el daño, las helicasas de TFIIH (un complejo de proteínas con funciones tanto en la REN-PG como en la REN-AT) desenrollan el ADN próximo y verifican la presencia de daños (fig. 2.10). La RPA se une al ADN monocatenario e impide que se vuelvan a formar enlaces de hidrógeno entre los pares de bases. El complejo ERCC1-endonucleasa XPF corta el ADN no desenrollado en sentido 5′ respecto a la lesión. Se elimina una sección de ∼30 nucleótidos, y una ADN polimerasa (p. ej., δ, ɛ o κ) vuelve a sintetizar la región que falta. Por último, una ADN ligasa (I o III) une el extremo 3′ de la región recién sintetizada al resto de la cadena de ADN.

FIG. 2.10

Reparación por escisión de nucleótidos de enlaces cruzados intracatenarios. Los enlaces cruzados pueden ser dímeros de TT-, CT- o CC-ciclobutano (inducidos por la radiación UV; v. fig. 2.6), nucleótidos únicos unidos a compuestos aromáticos policíclicos (como los que se encuentran en el humo del cigarrillo; v. fig. 2.7) o nucleótidos purínicos unidos a platino (p. ej., inducidos por cisplatino; v. fig. 2.8).

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Los pacientes con carencias de la REN-AT muestran la mayor parte de las veces retraso del desarrollo, envejecimiento prematuro y neurodegeneración. Algunos también son más sensibles a la radiación UV. Si se detienen y paran muchos puntos de transcripción durante periodos prolongados, la célula sufre muerte celular programada (apoptosis; v. cap. 8). Los pacientes que tienen alteraciones específicamente en la REN-PG tienden a tener cáncer de aparición a edades muy tempranas (en parte inducido por la radiación UV) porque, durante la replicación del ADN, las ADN polimerasas translesionales propensas a errores (v. cap. 3) pasan por alto muchas lesiones no reparadas. La reparación incorrecta de los enlaces cruzados intracatenarios favorece la formación de tumores. La reparación inadecuada de los daños inducidos por la radiación UV es importante en la aparición de carcinomas basocelulares, carcinomas escamocelulares y melanomas de la piel (v. fig. 2.6). La reparación inadecuada de los daños inducidos por el tabaco es importante en la aparición del cáncer de pulmón (v. fig. 2.7). Se observan carencias hereditarias debilitantes de la REN en varias enfermedades poco habituales con herencia autosómica recesiva, como xerodermia pigmentosa, síndrome de Cockayne y una forma de tricotiodistrofia fotosensible (todas aparecen en menos de 1 de cada 100.000 personas). A su vez, todas estas enfermedades se pueden subdividir en varios tipos dependiendo de la proteína que esté mutada. Los pacientes con xerodermia pigmentosa desarrollan fácilmente tumores cuando están expuestos a la radiación UV y también tienen mayor susceptibilidad al cáncer debido al tabaco o a los carcinógenos de la alimentación. El síndrome de Cockayne se caracteriza por emaciación y talla corta, además de deterioro neurológico, y muchas veces también fotosensibilidad. La tricotiodistrofia se caracteriza por cabello frágil y a veces también fotosensibilidad. Estos trastornos ponen claramente de manifiesto la importancia de los componentes del sistema de la REN. La reparación inadecuada de los daños inducidos por fármacos se aprovecha para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, las células del cáncer testicular tienen una baja capacidad de REN y, en consecuencia, experimentan fácilmente la muerte celular programada (v. sección 5 y cap. 8) cuando se las expone a fármacos que contienen platino. Esta sensibilidad a los fármacos es un motivo importante de la elevada tasa de curación del cáncer testicular que se consigue con una terapia que incluye cisplatino (v. figs. 2.8 y 2.9). La vía de la REN actúa de forma concertada con la RH (v. sección 4.2) para reparar los enlaces cruzados intercatenarios, como los que generan los compuestos de platino, las mostazas nitrogenadas y el psoraleno.

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4. Reparación de las roturas de la doble cadena y los enlaces cruzados intercatenarios Las células que no están en división reparan las roturas de la doble cadena principalmente mediante UENH. Las células en división reparan las roturas de la doble cadena y los enlaces cruzados intercatenarios mediante una combinación de UENH y RH. La reparación por RH supone la copia de la información de una cromátida hermana próxima o del cromosoma homólogo. Los pacientes que tienen carencias hereditarias de la reparación por RH tienen diversos síndromes de cáncer.

4.1. Unión de extremos no homólogos Las radiaciones ionizantes (p. ej., en forma de rayos X de alta energía) pueden dar lugar a roturas de una sola cadena y roturas de las dos cadenas. La radiación ionizante daña el ADN directa o indirectamente mediante la formación de radicales libres que dañan el ADN (principalmente radicales hidroxilo, OH•, a partir del agua). Cuando las radiaciones ionizantes cortan las dos cadenas del ADN a menos de 10-20 pares de bases la una de la otra, los cortes generan una rotura de la doble cadena. Los extremos de las roturas a menudo contienen un grupo fosfato inadecuado o un fragmento de desoxirribosa. En células que no están en división, las roturas de la doble cadena se reparan principalmente mediante UENH (fig. 2.11). Las proteínas Ku70 (también llamada XRCC6) y Ku80 (también llamada XRCC5) se unen a los extremos rotos del ADN. Las proteínas Ku atraen la subunidad catalítica de la proteincinasa dependiente de ADN y la nucleasa Artemis, que procesa los extremos de las cadenas si es necesario. El procesamiento final se puede acompañar de pérdida de nucleótidos. Cuando es necesario, las ADN polimerasas λ y µ insertan posteriormente nucleótidos con o sin una plantilla. Después, un complejo de ADN ligasa (formado por XLF, XRCC4 y ADN ligasa IV) liga los extremos del ADN. Este complejo de ligasa tolera algunos espacios vacíos y errores de emparejamiento. (Al contrario de las roturas de la doble cadena, las roturas de una cadena única se reparan mediante REB; v. sección 1.)

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FIG. 2.11

Reparación de las roturas de la doble cadena inducidas por la radiación mediante unión de extremos no homólogos. Parte de la radiación es natural. La radiación también es un pilar del tratamiento del cáncer.

La UENH puede introducir mutaciones y, en consecuencia, es un proceso potencialmente tumorígeno. Pese a todo, se piensa que estas mutaciones son menos lesivas para las células que las roturas de la doble cadena de ADN no reparadas, porque los extremos no protegidos del punto de rotura serían degradados. Además, algunos de los segmentos de ADN no reparados carecerían de centrómeros o telómeros, lo que sería catastrófico para el genoma de una célula. La UENH puede seguir varias vías incluso con el mismo daño inicial. Las mutaciones causadas por la UENH a menudo están formadas por deleciones de 1 a 10 nucleótidos, o inserciones de tres o menos nucleótidos. Cuando un núcleo contiene numerosos fragmentos de ADN bicatenario, la UENH incluso conlleva el riesgo de unir los fragmentos de ADN erróneos, lo que lleva a una translocación (material de un cromosoma se une a otro cromosoma). Esto puede hacer que un segmento codificante de proteínas de un gen esté controlado por un promotor que induce transcripción aberrante y, en consecuencia, la producción de proteínas patógenas. Como se describe en el capítulo 8, una mayor incidencia de mutaciones prepara el camino para la aparición de un tumor. La irradiación intensa de las células con radiaciones ionizantes produce daños tan extensos y persistentes del ADN que las células afectadas y muy

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dañadas sufren muerte celular programada; esta es la base de la radioterapia de los tumores. La radioterapia tiene como objetivo no solo introducir roturas en las dos cadenas, sino también lesiones adicionales del ADN en la región de la rotura. Las células que tienen ADN con estas lesiones agrupadas tienen una elevada probabilidad de morir. En el sistema inmunitario adaptativo, la UENH participa en la recombinación de los segmentos V, D y J de los anticuerpos y los receptores de linfocitos T. Las imprecisiones de la UENH contribuyen a aumentar la diversidad de los anticuerpos y de los receptores de linfocitos T. Los pacientes que tienen una carencia de la UENH también pueden tener una carencia en el sistema inmunitario adaptativo.

4.2. Reparación por recombinación homóloga (reparación dirigida por la homología) La reparación por RH, igual que la UENH descrita más arriba, repara las roturas de la doble cadena de ADN. La mayoría de las veces, la RH utiliza una cromátida hermana como plantilla para la reparación. Al contrario de la UENH, la RH generalmente es precisa. En las fases S y G2 del ciclo celular pueden surgir roturas de la doble cadena, principalmente por problemas con la replicación del ADN (v. cap. 3), como roturas de una cadena única no reparadas o complejos del ADN con una topo isomerasa intoxicada. Se estima que una célula normal en división en circunstancias fisiológicas tiene que reparar ∼50 roturas de la doble cadena por cada ciclo celular, y casi todas estas roturas son manejadas por la RH. Los enlaces cruzados intercatenarios se reparan mediante REN sola (RENPG y/o REN-AT; v. sección 3) o mediante una combinación obligatoria de reparación por RH y REN. (Los enlaces cruzados intracatenarios se reparan mediante REN.) Los enlaces cruzados intercatenarios se deben a fármacos con platino, mostazas nitrogenadas o psoralenos. Los fármacos con platino (p. ej., cisplatino y carboplatino) y las mostazas nitrogenadas (p. ej., ciclofosfamida) se utilizan en quimioterapia para destruir las células tumorales. Los psoralenos (p. ej., metoxipsoraleno) se utilizan para el tratamiento de la psoriasis y el vitíligo. La radiación UV induce a los psoralenos a formar ciclobutanos con restos de bases pirimidínicas de las dos cadenas de una doble hélice de ADN. La psoriasis (fig. 2.12) es un trastorno cutáneo frecuente que se caracteriza por hiperproliferación de los queratinocitos; el tratamiento con un psoraleno más luz reduce esta proliferación excesiva. El vitíligo (v. fig. 35.18) es un trastorno que supone la pérdida parcheada de la pigmentación cutánea y afecta al 1-2% de la población. La pérdida de pigmentación se debe a la ausencia de células productoras del pigmento melanina, lo que a su vez puede deberse a una inflamación (v. cap. 35). El tratamiento con un psoraleno más luz es eficaz y podría actuar reduciendo la inflamación. Aunque los psoralenos destruyen algunas células, tal y como cabía esperar también incrementan la incidencia

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de mutaciones en otras células, lo que explica el efecto adverso de aumento de la incidencia de cáncer cutáneo.

FIG. 2.12 La psoriasis a veces se trata con psoralenos fotorreactivos, que dan lugar a enlaces cruzados intra- e intercatenarios en el ADN.

Después de que se produzca una rotura de doble cadena, el complejo MRN (formado por Mre11, Rad50 y Nbs1) se une a los extremos del ADN y activa la cinasa de transducción de señales ATM (mutada en la ataxia telangiectasia). A su vez, la ATM fosforila numerosas proteínas, algunas de las cuales detienen el ciclo celular, mientras que otras incrementan la actividad de reparación del ADN. El complejo MRN corta una cadena de ADN a ∼100-200 pares de bases más allá de la rotura y después reseca esta cadena en dirección a la rotura. Otro complejo de proteínas reseca la misma cadena en el sentido opuesto, de manera que se genera una porción redundante de una cadena que puede medir más de 1.000 pb de longitud. Se genera una porción redundante de este tipo en cada uno de los fragmentos de ADN rotos. Mientras tanto, el complejo MRN también une los extremos de los dos fragmentos de ADN. La proteína BRCA1 forma un dímero con la proteína PALB2 y atrae la proteína BRCA2, que a su vez ayuda a cargar la recombinasa RAD51, que a su vez favorece la invasión de una cromátida hermana o de un cromosoma homólogo por una porción redundante en sentido 3′. La cadena de ADN invadida sirve como plantilla para la elongación de la porción redundante 3′. Posteriormente, las helicasas y las nucleasas resuelven las cadenas de ADN enmarañadas. El uso de un homólogo para la reparación por RH lleva a la conversión génica, que puede ser causa de pérdida de la heterocigosidad (PDH). Los cromosomas homólogos, procedentes de la madre y del padre, contienen secuencias similares, pero no idénticas. El término conversión génica se refiere al hallazgo de que la secuencia de un alelo parental se convierte en la secuencia del otro alelo parental. Por lo tanto, una célula somática con una copia funcional y otra no funcional de un gen puede dar lugar a una célula con dos copias no funcionales. La PDH también se puede utilizar para

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describir la deleción de la secuencia examinada. Se aplica el término disomía uniparental cuando hay pérdida de un cromosoma o un segmento de un cromosoma (que habitualmente contiene múltiples genes) de un progenitor y ganancia de la secuencia perdida desde el otro cromosoma parental. En pacientes heterocigotos para una carencia de un supresor tumoral, la reparación por RH puede llevar a la pérdida completa de la actividad del supresor tumoral, lo que puede ser tumorígeno (v. cap. 8). El deterioro de la actividad del complejo MRN o de la cinasa ATM lleva a un aumento de la incidencia de mutaciones y a una mayor sensibilidad a las radiaciones ionizantes terapéuticas. La ataxia-telangiectasia, que se ve en aproximadamente uno de cada 300.000 nacimientos, se debe a homocigosidad o heterocigosidad compuesta para mutaciones inactivadoras del gen de ATM. El síndrome de rotura de Nimega y la enfermedad similar a la ataxiatelangiectasia son enfermedades mucho más infrecuentes que se deben a homocigosidad o heterocigosidad compuesta para mutaciones inactivadoras que afectan al complejo MRN. En cerca del 20% de los tumores mamarios se ven también menores cantidades del complejo MRN. Aproximadamente el 5% de las mujeres que tienen cáncer de mama (fig. 2.13), o el ∼0,1% de todos los hombres y mujeres, han heredado una mutación de los genes BRCA1 o BRCA2. Con el paso del tiempo, el alelo BRCA normal restante se pierde o inactiva. Sin proteínas BRCA funcionales, las células acumulan alteraciones del ADN a una velocidad mayor y por ello son propensas a la tumorigenia. Las pacientes con una mutación hereditaria de BRCA tienen mayor riesgo de cáncer de mama, cáncer de ovario y otros tumores. La propensión a la formación de tumores se hereda con un patrón autosómico dominante (como en el síndrome de Lynch, v. sección 2). La heterocigosidad para un alelo BRCA1 o BRCA2 defectuoso es una causa frecuente del síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario (SCMOH).

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FIG. 2.13 Aproximadamente el 10% de las mujeres tienen cáncer de mama a lo largo de la vida, y cerca del 5% de estas pacientes heredaron un alelo de BRCA mutante que codifica una proteína con una alteración funcional. Con el tiempo, el otro alelo, el normal, deja de ser funcional, lo que reduce la reparación del ADN por recombinación homóloga. Las células sin un mecanismo funcionante de reparación por recombinación homóloga acumulan mutaciones a una velocidad elevada y tienen más probabilidad de dar lugar a un tumor. Se puede estudiar a los pacientes para detectar mutaciones del gen BRCA.

La heterocigosidad para una mutación del gen PALB2 en la línea germinal se asocia a mayor riesgo de cáncer pancreático y cáncer de mama. En conjunto, las mutaciones de PALB2 y BRCA2 son responsables de una proporción elevada de cánceres de páncreas hereditarios (también contribuyen las mutaciones de un gen de una proteína de la REE y las mutaciones del gen CDKN2A). Las mutaciones de PALB2 son responsables de un porcentaje bajo de casos de cáncer de mama hereditario. La anemia de Fanconi es un síndrome hereditario infrecuente que se caracteriza por insuficiencia de la médula ósea que produce anemia, leucopenia y trombopenia, además de malformaciones. Las personas afectadas tienen riesgo elevado de presentar neoplasias malignas hemáticas y

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tumores sólidos. Los pacientes con anemia de Fanconi son homocigotos, heterocigotos compuestos o hemicigotos para una proteína mutante de la red de la anemia de Fanconi (también llamada vía de la anemia de Fanconi). La red completa está formada por al menos 16 proteínas que participan en la reparación del ADN. PALB2 y BRCA2 son miembros de la red de la anemia de Fanconi. Los pacientes que tienen dos alelos BRCA2 mutantes tienen el tipo D1 de anemia de Fanconi, y los pacientes que tienen dos alelos PALB2 mutantes tienen el tipo N. Complejos de proteínas de la red de la anemia de Fanconi coordinan algunos de los pasos de escisión del ADN, invasión de la cadena y resolución de la RH. En la población general, varios tipos de tumores esporádicos son deficitarios en una de las proteínas de la red de la anemia de Fanconi, lo que explica la susceptibilidad de estos tumores a los fármacos que producen enlaces cruzados en el ADN. Los pacientes que tienen anemia de Fanconi son hipersensibles a las radiaciones ionizantes y a los fármacos que producen enlaces cruzados en el ADN (p. ej., cisplatino y ciclofosfamida). La RH no solo es importante en la reparación del ADN, sino también en la formación de solapamientos en la meiosis con el fin de identificar y emparejar cromosomas homólogos, lo que incrementa la diversidad genética entre la descendencia.

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5. La respuesta al daño del ADN detiene el ciclo celular y regula la apoptosis Como se resume en el capítulo 8, el cáncer es la consecuencia del daño del genoma, de manera que ya no están adecuadamente regulados el crecimiento y la supervivencia celulares. La reparación inadecuada del ADN incrementa la tasa de mutaciones y así favorece la formación de un tumor. Las células tienen medios para evaluar el daño del ADN y determinar si deben sobrevivir o autodestruirse. La respuesta al daño del ADN de una célula detecta el daño del ADN, ralentiza la progresión por el ciclo celular y coordina esta respuesta con la reparación del ADN. Cuando el daño del ADN es persistente, la respuesta también puede iniciar la apoptosis. La mayor parte de las vías de reparación del ADN se analizan en las secciones 1 a 4. La síntesis de ADN translesional se analiza en la sección 2 del capítulo 3. La figura 2.14 muestra una visión general de estas vías de reparación.

FIG. 2.14 Visión general de las vías de reparación del ADN. La replicación del ADN y la síntesis de ADN translesional se explican en el capítulo 3.

La respuesta al daño del ADN se ha estudiado mejor en células que contienen roturas de las dos cadenas. Estas roturas finalmente llevan a la activación de las cinasas ATR y ATM, que a su vez activan las cinasas de punto de control Chk1 y Chk2. Mediante varios mecanismos, las cinasas de punto de control detienen el ciclo celular, lo que bloquea la transición G1/S, la fase S, la transición G2/M o la fase M (v. sección 1 en el cap. 8). Esto permite que las vías de reparación del ADN, incluyendo la síntesis de ADN translesional, reparen el daño del ADN. Las vías de reparación del ADN muchas veces son redundantes: aunque un tipo particular de daño habitualmente es reparado principalmente por una vía, muchas veces puede ser reparado por una vía alternativa. Si se repara un

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daño del ADN, se elimina la señal que bloquea el ciclo celular y se reinicia la progresión por el ciclo. Si no se repara el daño, persiste la señal de daño del ADN y puede desencadenarse la apoptosis. Algunos fármacos quimioterápicos destruyen las células induciendo daños del ADN que son tan intensos que las células sufren apoptosis. La sensibilidad de las células normales y anormales a las alteraciones del ADN inducidas por la quimioterapia depende de muchas variables, como la captación y la salida del fármaco, la capacidad de reparación del ADN, la capacidad de las células de detectar y transducir la respuesta al daño del ADN y la probabilidad de que el daño del ADN lleve a la apoptosis. Muchas células tumorales tienen alteraciones en la sensibilidad a la apoptosis inducida por los daños del ADN. Las células que sobreviven al daño por fármacos quimioterápicos (p. ej., porque hay alteraciones en la regulación de la entrada en la apoptosis o porque los mecanismos detectores del daño del ADN no detectan las lesiones) pueden dar lugar a un nuevo tumor o agravar el comportamiento de un tumor ya existente. Las radiaciones ionizantes intensas, como las que se utilizan para la radioterapia del cáncer, producen la muerte celular no solo por el mero volumen del daño que sufre el ADN, sino también porque agrupan el daño en solo una o dos vueltas de la hélice de ADN. No está claro por qué los daños agrupados son particularmente letales.

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Resumen ■ La vía de reparación por escisión de bases (REB) repara el daño causado por desaminación, hidroxilación, metilación, pérdida de una base, alteración de una desoxirribosa o rotura de una sola cadena. Este daño es la consecuencia de las propiedades químicas del ADN, los efectos destructivos de otros componentes celulares o las radiaciones ionizantes. La vía de reparación de parche corto reemplaza un único nucleótido dañado, mientras que la vía de reparación de parche largo reemplaza una cadena de 2 a 10 nucleótidos consecutivos. La cadena de ADN complementaria sirve como plantilla para la inserción de nucleótidos. ■ La poliposis asociada a MUTYH (PAM) está causada por una carencia homocigota o heterocigota compuesta de la ADN MYH glucosilasa, que participa en la reparación de la 8-oxoguanina (producida a partir de la guanina por un radical). La enfermedad se asocia a la formación de numerosos pólipos en el colon, así como al cáncer colorrectal temprano. ■ Los procesos de reparación de los errores de emparejamiento del ADN (REE) actúan sobre errores de emparejamiento de una sola base del ADN y bucles del ADN, que se originan por errores en la síntesis del ADN, desaminación espontánea de C a U o de metil-C a T, o por reparación por recombinación homóloga (RH). Las enzimas de la vía de la REE del ADN degradan y vuelven a sintetizar una parte de la cadena de ADN, que suele ser la cadena sintetizada más recientemente. ■ El síndrome de Lynch se debe a una carencia hereditaria de la REE. Las carencias tanto hereditarias como adquiridas de la REE pueden causar cáncer, especialmente de colon, útero y ovarios. La carencia de la REE en las células tumorales muchas veces se puede detectar como una carencia en la tinción inmunohistoquímica de las proteínas de la REE y como inestabilidad de los microsatélites (IMS) del ADN (es decir, acortamiento de la longitud de determinadas repeticiones de nucleótidos). ■ La reparación por escisión de nucleótidos (REN) supone la eliminación y la correspondiente sustitución de una porción contigua de ∼24-32 nucleótidos alrededor de una lesión que distorsiona la hélice en una cadena de una doble hélice de ADN. Estas lesiones habitualmente se originan por la formación de enlaces cruzados entre las bases pirimidínicas (T o C) por exposición a la radiación UV, por la reacción de los metabolitos de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (presentes en el humo de tabaco) con las bases purínicas (A o G) o por la formación de enlaces cruzados entre bases purínicas

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adyacentes mediada por fármacos con platino (que se utilizan para la quimioterapia antitumoral). Una elevada tasa de producción de lesiones del ADN que causan distorsión de la hélice se asocia a mayor riesgo de cáncer (p. ej., melanoma y cáncer de pulmón). ■ Después de una rotura de la doble cadena, la RH supone la resección de una cadena para producir una porción redundante larga de una sola cadena, la invasión de la cromátida homóloga, la copia de la información y la separación de las dos cromátidas. ■ Las radiaciones ionizantes (p. ej., rayos X de alta energía) causan roturas de la doble cadena que se pueden reparar mediante UENH o RH. ■ Los fármacos que contienen platino, las mostazas nitrogenadas y los psoralenos fotorreactivos, que se utilizan en terapéutica, producen enlaces cruzados intercatenarios que se pueden reparar mediante reparación por RH. Las proteínas BRCA1 y BRCA2 participan en la reparación por RH. Las mutaciones de los genes BRCA pueden conferir mayor susceptibilidad a los cánceres de mama y ovario. ■ Las vías que detectan el daño del ADN pueden detener el ciclo celular para dar tiempo a la reparación del ADN. Las células con daños excesivos y no reparados del ADN a menudo sufren apoptosis. Algunos de los fármacos que se utilizan para la quimioterapia antineoplásica destruyen las células causando daños en el ADN que superan la capacidad de reparación de las células. Estos fármacos son inherentemente mutágenos para todas las células.

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Lecturas recomendadas ■ Brenerman BM, Illuzzi JL, Wilson III DM. Base excision repair capacity in informing healthspan. Carcinogenesis. 2014;35:2643–2652. ■ Erie DA, Weninger KR. Single molecule studies of DNA mismatch repair. DNA Repair (Amst). 2014;20:71–81. ■ Lafrance-Vanasse J, Williams GJ, Tainer JA. Envisioning the dynamics and flexibility of Mre11-Rad50-Nbs1 complex to decipher its roles in DNA replication and repair. Prog Biophys Mol Biol. 2015;117:182–193. ■ Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 1993;362:709–715. ■ Marteijn JA, Lans H, Vermeulen W, Hoeijmakers JH. Understanding nucleotide excision repair and its roles in cancer and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15:465–481. ■ Mehta A, Haber JE. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2014;6(9):a016428.

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CAPÍTULO 3

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Replicación del ADN Sinopsis ■ Durante la replicación del ADN, cada una de las cadenas del ADN sirve de plantilla para la síntesis de una nueva cadena de ADN complementaria. La replicación comienza en muchos puntos de cada cromosoma. Conforme el ADN bicatenario se abre para su replicación, se puede copiar una cualquiera de las cadenas continuamente en una dirección, aunque se debe copiar en muchos segmentos pequeños en la dirección opuesta. ■ Las ADN polimerasas translesionales facilitan que continúe la replicación del ADN por medio de lesiones del ADN no reparadas. ■ Los telómeros, los extremos de los cromosomas, se acortan con cada tanda de replicación. Este acortamiento es importante en la senescencia. Las células de la línea germinal y las células progenitoras utilizan la telomerasa para mantener constante la longitud de sus telómeros.

Objetivos de aprendizaje Para dominar este tema, debería ser capaz de hacer lo siguiente: ■ Resumir la replicación del ADN. ■ Describir los factores que contribuyen a la fidelidad de la replicación del ADN. ■ Describir la estructura de los telómeros, explicar el mecanismo por el que la replicación produce acortamiento de los telómeros y describir de qué manera algunas células seleccionadas mantienen una longitud adecuada de sus telómeros.

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1. Replicación del ADN Durante la replicación, cada una de las cadenas de una doble hélice de ADN sirve como plantilla para la síntesis de una nueva cadena de ADN complementaria. La topoisomerasa I libera tensión superhelicoidal, y las helicasas catalizan la separación de las cadenas de ADN complementarias. La replicación de una sección del ADN comienza con la síntesis de un cebador de ARN. Después, la ADN polimerasa cataliza la adición de desoxirribonucleótidos. Por último, el cebador de ARN es sustituido por desoxirribonucleótidos. El empaquetado del ADN nuclear en nucleosomas, fibras de cromatina de 30 nm y estructuras de orden superior se describe en el capítulo 1. Como preparación para la replicación del ADN (es decir, el copiado del genoma), las estructuras de orden superior del ADN son desmanteladas por los factores de remodelado de la cromatina, que incluyen enzimas que modifican las proteínas de la cromatina (p. ej., acetilasas y desacetilasas, metilasas y desmetilasas, cinasas y fosfatasas) y proteínas que sustituyen a las proteínas existentes en la cromatina. El ADN nuclear se replica durante la fase S del ciclo celular (v. cap. 8), que habitualmente dura varias horas. El ADN mitocondrial se replica cuando es necesario, y su replicación puede ser independiente de la del ADN nuclear. A continuación se describe la replicación del ADN en el núcleo. La replicación de la doble hélice de ADN es semiconservadora: cada una de las cadenas de una doble hélice de ADN ya existente sirve como plantilla para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Al final de este proceso, cada una de las dos dobles hélices contiene una de las antiguas cadenas de ADN y una de las cadenas de ADN recién sintetizadas (fig. 3.1).

FIG. 3.1

La replicación del ADN es semiconservadora.

Durante la replicación, la síntesis del ADN avanza del extremo 5′ al 3′ (fig. 3.2). El grupo hidroxilo situado en el extremo 3′ de una cadena de ADN en crecimiento realiza un ataque nucleofílico sobre el átomo de fósforo del desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP) entrante que está más próximo al azúcar (es decir, el fosfato α del dNTP entrante). Si el nucleótido del extremo 3′ de una cadena de ADN carece del grupo hidroxilo en posición 3′, la cadena de ADN no se puede alargar.

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FIG. 3.2 La replicación del ADN avanza del extremo 5′ al 3′ y se detiene cuando se incorporan didesoxirribonucleótidos sintéticos que carecen del grupo hidroxilo en posición 3′. Los didesoxirribonucleótidos se utilizan en clínica para tratar el cáncer y en el laboratorio para el secuenciado del ADN y diversas pruebas basadas en el ADN.

La replicación puede comenzar en miles de regiones determinadas, los orígenes de la replicación (ORI). Los ORI están espaciados a intervalos de ∼50.000-300.000 pares de bases. El uso de estos orígenes está regulado. Hay orígenes de replicación tempranos y tardíos. Además, la mayor parte de los orígenes no se utilizan nunca en circunstancias normales (es decir, están latentes). Los orígenes latentes se pueden activar cuando la replicación se detiene. Los procesos siguientes garantizan que el ADN alrededor de cada ORI se replique solamente una vez por cada ciclo celular: Durante la fase G1 del ciclo celular, inmediatamente antes de la fase S (v. cap. 8), complejos de reconocimiento de orígenes multiproteínicos se ensamblan a los ORI en un proceso denominado licenciamiento. Esto sucede solo en presencia de factores de carga, que a su vez están presentes únicamente durante esta fase G1. En la transición de la fase G1 a la fase S, y durante la fase S (cuando ya no están presentes los factores de carga), se activa una helicasa impulsada por ATP en el complejo ensamblado, y el complejo se separa del ORI. La actividad de las cinasas dependientes de ciclina (CDK; v. cap. 8) es elevada cuando las células salen de G1 y entran en la fase S, y se mantiene elevada hasta que tiene lugar la segregación cromosómica durante la fase M. Esta elevada actividad de las CDK inhibe el licenciamiento durante las fases S y M, lo que previene la replicación. Comenzando en un ORI, la separación de las cadenas de ADN complementarias da lugar a dos horquillas de replicación (fig. 3.3). A medida que las helicasas activadas por ATP separan la doble hélice de ADN para dar las cadenas sencillas, proteínas de unión a las cadenas sencillas, como la RPA (proteína de replicación A), se enroscan parcialmente alrededor de la cadena de ADN sencilla e impiden la hibridación de las bases dentro de la misma cadena o con la cadena de ADN complementaria. La topoisomerasa I elimina la tensión superhelicoidal del ADN (v. cap. 1). Cada una de las cadenas de la doble hélice de ADN se lee en sentido 3′→5′, lo que da lugar a nuevas cadenas de ADN complementarias que se llaman cadenas adelantadas (v. figs. 3.3 y 3.5). Conforme avanza la replicación queda sin copiar una longitud cada vez mayor de ADN en el lado 3′ del ORI, porque la plantilla solo se puede leer en sentido 3′→5′. Cuando ya se han expuesto aproximadamente de 100 a 200 bases no copiadas, una ADN polimerasa actúa también sobre estas cadenas, generando fragmentos de ADN de 100 a 200 nucleótidos de longitud que se denominan fragmentos de Okazaki (v. figs. 3.3 y 3.5). Posteriormente se ligan los fragmentos de Okazaki, y esta cadena se denomina cadena retrasada. En consecuencia, la síntesis de la cadena adelantada es continua, mientras que la síntesis de la cadena

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retrasada es discontinua.

FIG. 3.3

Horquillas de replicación durante la replicación del ADN.

FIG. 3.4

Síntesis del cebador durante la replicación del ADN.

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FIG. 3.5

Replicación del ADN, que muestra las cadenas adelantada y retrasada en una horquilla de replicación.

La ADN polimerasa α es un complejo enzimático de múltiples subunidades que contiene una ADN polimerasa y una ARN polimerasa. Utiliza ribonucleósidos trifosfato (p. ej. ATP, CTP, GTP, UTP) para sintetizar un cebador de ARN complementario de ∼7 a 12 nucleótidos de longitud (v. figs. 3.4 y 3.5). Después, la ADN polimerasa prolonga el cebador de ARN en ∼20 nucleótidos. Todo el ARN y el ADN se sintetizan mediante la adición de un nucleósido 5′-trifosfato al grupo 3′-hidroxilo del nucleótido precedente (es decir, la cadena recién sintetizada crece en sentido 5′→3′). Ni la ARN polimerasa ni la ADN polimerasa del complejo de la ADN polimerasa α pueden llevar a cabo la corrección de errores; por lo tanto, el complejo incorpora nucleótidos no complementarios con mayor frecuencia que la ADN polimerasa δ (v. más adelante). La ADN polimerasa δ (la ADN polimerasa responsable de la incorporación de la mayor parte de los nucleótidos) y la ADN polimerasa ɛ (que tiene una importancia menor y no se muestra en la fig. 3.5) alargan la cadena sintetizada por la ADN polimerasa α. Cada polimerasa tiene una función de corrección de errores; si las bases de la cadena de ADN en crecimiento no coinciden con la plantilla, la enzima se detiene, escinde el nucleótido emparejado erróneamente y después continúa la polimerización. Cuando la ADN polimerasa δ llega al cebador de ARN en la cadena retrasada, se desplazan y escinden el cebador y los hasta ∼30 desoxirribonucleótidos siguientes. La ADN polimerasa δ inserta los nucleótidos complementarios faltantes, y la ADN ligasa une el extremo 3′ del fragmento de ADN sintetizado más recientemente al correspondiente extremo 5′ del fragmento de ADN sintetizado previamente. La replicación del ADN tiene una fidelidad muy elevada. De promedio, cada replicación del genoma humano (que contiene ∼3.000 millones de pares de bases) introduce solo aproximadamente tres cambios de base. La elevada precisión se debe en gran parte a la especificidad de sustrato y la función de

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corrección de errores de la ADN polimerasa δ, además de la eficiencia de la reparación de errores de emparejamiento del ADN después de la replicación (v. sección 2 en el cap. 2). Después de la replicación, el ADN se ensambla para formar nucleosomas y estructuras de cromatina de orden superior utilizando los factores de ensamblado de la cromatina, que incluyen las histonas ya existentes y recién sintetizadas. Se utilizan ADN polimerasas y ADN ligasas de diversos organismos para métodos diagnósticos del ADN in vitro (v. cap. 4). Los didesoxirribonucleótidos que interfieren con la replicación del ADN se utilizan en la quimioterapia antineoplásica, como antivíricos, en el diagnóstico del ADN y en el secuenciado tipo Sanger del ADN (v. cap. 4). Los nucleótidos que no tienen un grupo hidroxilo en posición 3′ (p. ej., ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP) se pueden incorporar al ADN, pero como carecen de grupo hidroxilo en posición 3′, ponen fin a la cadena (v. fig. 3.2). La zidovudina y la lamivudina (fig. 3.6) inhiben las retrotranscriptasas víricas (enzimas que copian el ARN vírico para dar ADN), aunque tan solo tienen un efecto pequeño sobre las ADN polimerasas humanas. Los dos fármacos se utilizan contra las infecciones por retrovirus (es decir, virus que contienen un genoma de ARN). La zidovudina es un análogo de la timidina. Las enzimas de la célula convierten la zidovudina en su forma trifosfato, y la retrotranscriptasa la incorpora posteriormente a las cadenas de ADN en crecimiento. Estas cadenas de ADN no se pueden alargar porque la zidovudina carece de grupo hidroxilo en posición 3′. La lamivudina también se fosforila en el interior de las células y después inhibe de forma intensa las retrotranscriptasas víricas, pero no las ADN polimerasas humanas. Igual que la zidovudina, la lamivudina también actúa como finalizador de la cadena. La lamivudina se utiliza para el tratamiento de la hepatitis B y el virus de la inmunodeficiencia humana-1.

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FIG. 3.6

Fármacos que inhiben preferentemente la síntesis de ADN en los retrovirus. La zidovudina es un análogo de la timidina, y la lamivudina es un análogo de la desoxicitidina. Los residuos que difieren del nucleósido fisiológico se muestran en rojo.

La arabinosilcitosina y la fludarabina (fig. 3.7) interfieren con la replicación del ADN. Ambos fármacos se utilizan para el tratamiento de las leucemias agudas. Estos fármacos se fosforilan en el interior de las células. La ADN polimerasa incorpora al ADN arabinosilcitosina trifosfato y fludarabina trifosfato. Sin embargo, estos nucleótidos sintéticos son sustratos inadecuados para la escisión y la sustitución, así como para la replicación continuada. La reducción de la replicación lleva a roturas de la doble cadena. Además, la fludarabina del extremo 3′ terminal de un fragmento de ADN impide la ligadura por la ADN ligasa, lo que lleva a roturas persistentes de una sola cadena (es decir, ADN cortado). Una vez que una célula ha incorporado aproximadamente 100.000 moléculas de fludarabina a su ADN, sufre apoptosis.

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FIG. 3.7 Fármacos que inhiben la replicación del ADN. La arabinosilcitosina es un análogo de la citidina, y la fludarabina es un análogo de la adenosina. Los residuos que difieren del nucleósido fisiológico se muestran en rojo.

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2. Síntesis de ADN translesional La síntesis de ADN translesional se realiza durante la replicación del ADN por la acción de polimerasas que detectan nucleótidos dañados que escapan a los mecanismos de reparación del ADN. Estas ADN polimerasas habitualmente incorporan el nucleótido correcto enfrente de uno dañado, aunque no se repara la cadena de ADN dañada que actúa como plantilla. Durante la replicación del ADN se atraen ADN polimerasas permisivas (ADN polimerasas translesionales) hasta las lesiones del ADN que han escapado a la reparación por las vías de escisión de bases, reparación de errores de emparejamiento y escisión de nucleótidos (v. cap. 2). Las principales ADN polimerasas replicativas α y δ generalmente no pueden copiar nucleótidos dañados. Por el contrario, las ADN polimerasas permisivas copian un amplio espectro de daños del ADN, pero también tienen una fidelidad de copia menor que la ADN polimerasa δ. Las polimerasas permisivas son mucho más activas cuando tienen como plantilla ADN dañado que ADN intacto; esta característica impide que las ADN polimerasas translesionales copien de forma inexacta segmentos largos de ADN no dañado. Las ADN polimerasas permisivas no reparan el daño de los nucleótidos del ADN que sirve como plantilla. Los seres humanos tienen varios tipos de ADN polimerasas permisivas: η (ita), ι (iota) y κ (kappa), entre otras. En conjunto, estas polimerasas pueden insertar A, T, C o G enfrente de un sitio abásico, insertar G enfrente de U (U deriva de C mediante desaminación), o insertar C enfrente de 8-oxoguanina, en lesiones que deberían haber sido reparadas por la vía de reparación por escisión de bases (v. cap. 2). Las ADN polimerasas permisivas también pueden insertar un dímero AA enfrente de dímeros de ciclobutano TT, T enfrente de aductos de hidrocarburos aromáticos policíclicos con A, C enfrente de aductos de hidrocarburos aromáticos policíclicos con G, o CC enfrente de enlaces cruzados intracatenarios GG con platino en lesiones que deberían haber sido reparadas por la vía de reparación por escisión de nucleótidos (v. cap. 2). La importancia fisiológica de la síntesis de ADN translesional es evidente en una forma variante de xerodermia pigmentaria, que se debe a una carencia de ADN polimerasa η (ita). Esta ADN polimerasa inserta un dímero AA enfrente de dímeros de ciclobutano TT (cataliza la síntesis de ADN también enfrente de otros nucleótidos dañados). Los pacientes afectados son extremadamente sensibles a la luz y tienen un riesgo elevado de cáncer.

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3. Replicación de los extremos de los cromosomas (telómeros) Los extremos de los cromosomas se denominan telómeros; están formados principalmente por repeticiones de la secuencia TTAGGG. Para que los complejos de reparación del ADN no confundan los telómeros con los extremos del ADN dañado, los extremos de las cadenas de ADN están plegados, y las repeticiones teloméricas están recubiertas por proteínas. En la mayor parte de las células somáticas, tras la replicación cada cadena de ADN pierde ADN telomérico hasta que, por último, los telómeros cortos inducen la senescencia celular. Por el contrario, la telomerasa mantiene la longitud de los telómeros en las células germinales, algunas células progenitoras y la mayor parte de las células tumorales. Los extremos de los cromosomas se denominan telómeros (fig. 3.8) y tienen una función importante en el envejecimiento y el cáncer. Impiden que los mecanismos de reparación del ADN ataquen los extremos de los cromosomas, constituyen un método para limitar el número de veces que se puede dividir una célula y pueden impedir la pérdida irreversible de información genética de los extremos de los cromosomas durante la replicación del ADN. Las células inmortales cancerosas escapan a la limitación de la división celular impuesta por los telómeros.

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FIG. 3.8 Cromosomas en metafase con sus telómeros. Un cromosoma en metafase está formado por dos cromátidas hermanas (v. sección 5 en el cap. 1). Cada cromátida tiene dos extremos y, en consecuencia, dos telómeros. Los cromosomas se tiñeron con una sonda de ácidos nucleicos de naturaleza peptídica, específica de los telómeros y que da fluorescencia rosa, y los cromosomas con la molécula de unión al ADN DAPI (4′,6-diamidino-2fenilindol), que da fluorescencia azul. (De Olaussen KA, Dubrana K, Domont J, Spano JP, Sabatier L, Soria JC. Telomeres and telomerase as targets for anticancer drug development. Crit Rev Oncol Hematol. 2006;57:191–214.)

Una estructura de nucleoproteínas teloméricas protege los telómeros del reconocimiento por los complejos de reparación del ADN (fig. 3.9). Los telómeros miden aproximadamente de 4.000 a 15.000 bases de longitud y están formados principalmente por repeticiones de la secuencia TTAGGG (5′-CCCTAA en la cadena complementaria). Las 20-35 últimas repeticiones de TTAGGG en el extremo 3′ de cada una de las cadenas de ADN no tienen equivalente en la cadena complementaria (es decir, forman un segmento sobresaliente monocatenario en el extremo 3′). Una porción bicatenaria del telómero se incurva hacia atrás, y el segmento sobresaliente monocatenario en posición 3′ invade una porción bicatenaria del telómero y se forma un bucle t. El ADN telomérico está cubierto por complejos de la proteína shelterina, que se une específicamente a las repeticiones del ADN telomérico, protege los telómeros e impide que sean reconocidos por las proteínas de reparación del ADN, y de esta manera impide la fusión de los cromosomas.

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FIG. 3.9

Estructura de un telómero.

En la mayor parte de las células somáticas, los telómeros se acortan con cada división celular (fig. 3.10). Por lo tanto, la longitud de los telómeros ofrece a las células un posible mecanismo para contar y limitar el número de divisiones celulares. Como las ADN polimerasas que participan en la replicación del ADN necesitan un ADN que actúe como plantilla en sentido 3′ respecto al sitio catalítico, la maquinaria de replicación normal que se ha descrito en la sección 1 no puede replicar el extremo 3′ de la cadena de ADN. Además, una exonucleasa degrada una porción de cada uno de los extremos 5′ para mantener la longitud del segmento sobresaliente en posición 3′. Mediciones in vitro muestran que los fibroblastos pierden de promedio de 40 a 120 pb por telómero con cada ciclo de replicación. Los fibroblastos que tienen un número relativamente pequeño de repeticiones de TTAGGG ya no se dividen (es decir, entran en senescencia replicativa) y se mantienen en la fase G0 del ciclo celular (v. cap. 8).

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FIG. 3.10 Acortamiento y alargamiento de los telómeros. El acortamiento de los telómeros se produce durante la replicación del genoma. Las células que expresan telomerasa pueden reconstruir la longitud de los telómeros.

El complejo proteínico de la telomerasa puede mantener la longitud de los telómeros añadiendo repeticiones de ADN telomérico, nucleótido a nucleótido, utilizando una plantilla de ARN (componente de ARN de la telomerasa, TERC) que está unido de forma estable al complejo proteínico. Por lo tanto, la telomerasa tiene actividad retrotranscriptásica que puede copiar repetidamente la secuencia 3′-CAAUCCCAAUC-5′ contenida en el ARN del TERC largo para generar las repeticiones de ADN telomérico 5′TTAGGG-3′. Numerosas proteínas regulan la colocación de la telomerasa sobre el ADN telomérico monocatenario. Una vez que la telomerasa se ha separado del telómero, los procesos de replicación o reparación del ADN añaden nucleótidos complementarios (desoxi-C, T y desoxi-A) al extremo 5′ de la cadena de ADN complementaria. Las células con un potencial alto o ilimitado de replicación, como las células progenitoras embrionarias, las células germinativas, las células progenitoras de la médula ósea o de las vellosidades intestinales, los linfocitos activados y las células tumorales, expresan la telomerasa. Por lo demás, las células somáticas normales habitualmente tienen una actividad telomerásica escasa o nula. Por motivos desconocidos, a pesar de la presencia de telomerasa en las células progenitoras, los telómeros de muchas células (p. ej., leucocitos circulantes, músculo, piel y tejido adiposo) se acortan ∼25 pb por cada año de edad. Factores como el tabaquismo, el estrés psicosocial, el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) aceleran el acortamiento.

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Los telómeros cortos se asocian a mortalidad elevada, mientras que las repeticiones largas se asocian a mayor riesgo de diversas neoplasias. Las telomeropatías hereditarias (síndromes teloméricos hereditarios) conocidas hasta la fecha se deben a mutaciones en una subunidad de la telomerasa o en una proteína que se une a los telómeros. La mayor parte de las mutaciones patógenas se acompañan de haploinsuficiencia, motivo por el que las telomeropatías habitualmente tienen una herencia autosómica dominante. Las alteraciones en el mantenimiento de los telómeros causan diversos síntomas que pueden incluir leucoplaquia (parches blancos en la mucosa oral), hiperpigmentación cutánea, distrofia ungueal, fibrosis pulmonar, insuficiencia medular y cirrosis hepática. Las células tumorales tienen mecanismos para evitar la senescencia replicativa y la apoptosis debidas al acortamiento de los telómeros. Las células precursoras tumorales pueden evitar la senescencia mediante la inactivación de un punto de control del ciclo celular (v. cap. 8). Conforme los telómeros siguen acortándose como consecuencia de la replicación del ADN, las células llegan a un punto crítico en el que los telómeros ya no protegen la información genética, y normalmente se produce la apoptosis; solo sobreviven las células que pueden tener telómeros protectores. De hecho, la mayor parte de las células tumorales inmortales tienen telomerasa activa que las ayuda a mantener los telómeros, aunque estos telómeros son relativamente cortos. En consecuencia, la telomerasa es una posible diana de los fármacos antitumorales. En una pequeña proporción de tumores los telómeros se mantienen mediante la recombinación de los extremos de los cromosomas o de fragmentos cortos de ADN circular que contienen repeticiones teloméricas; esto se denomina vía del alargamiento alternativo de los telómeros (AAT). Los telómeros que se mantienen por la vía del AAT son anormalmente largos y difieren mucho en cuanto a longitud. La vía del AAT se encuentra principalmente en los sarcomas.

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Resumen ■ La mayor parte del ADN nuclear se replica durante la fase S del ciclo celular. La replicación comienza en los orígenes de la replicación (ORI). Las helicasas separan las cadenas de ADN complementarias, mientras que las topoisomerasas alivian la tensión superhelicoidal por torsión. La ADN polimerasa α, que tiene fidelidad baja, sintetiza un cebador de ARN y después lo prolonga con desoxirribonucleótidos. Las ADN polimerasas δ y ɛ alargan la cadena de ADN en crecimiento con fidelidad elevada y también sustituyen el cebador de ARN y la región de ADN copiada de forma inexacta por una copia exacta de ADN. La ADN ligasa une fragmentos contiguos del ADN recién sintetizado. ■ A medida que se abre y replica la doble hélice de ADN en un ORI, una de las cadenas originales se lee continuamente, y la otra, de forma discontinua. La replicación discontinua del ADN da lugar a fragmentos de Okazaki, que posteriormente se ligan. ■ Los nucleótidos sin un grupo hidroxilo en el extremo 3′ pueden inhibir la replicación del ADN. ■ Durante la replicación, las ADN polimerasas translesionales η (ita), ι (iota) y κ (kappa) leen nucleótidos dañados en la plantilla de ADN que escaparon a los procesos de reparación. Estos nucleótidos dañados incluyen 8-oxoguanina, dímeros de timina ciclobutano, enlaces cruzados intercatenarios por cisplatino y aductos de hidrocarburos policíclicos con una base. Las polimerasas insertan un nucleótido en la cadena de ADN en crecimiento, aunque no reparan los nucleótidos dañados en la cadena que actúa como plantilla. ■ Los extremos de los cromosomas están recubiertos por telómeros. Los telómeros están formados por 700-2.500 repeticiones de TTAGGG, cuya porción terminal forma un bucle t. La shelterina recubre las repeticiones. En la mayor parte de las células somáticas los telómeros se acortan con cada ciclo de replicación, y los telómeros cortos inducen la senescencia replicativa. La telomerasa alarga los telómeros añadiendo repeticiones de TTAGGG de acuerdo con su propia plantilla interna de ARN. Las células germinales y algunas células progenitoras utilizan la telomerasa para mantener sus telómeros. Las células tumorales usan la telomerasa o una vía basada en la recombinación (llamada alargamiento alternativo de los telómeros) para mantener los telómeros. Una función anormal del complejo de la telomerasa puede llevar al envejecimiento prematuro de diversos tejidos (p. ej., médula ósea, pulmones e hígado).

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Lecturas recomendadas ■ Fragkos M, Ganier O, Coulombe P, Méchali M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015;16:360–374. ■ Holohan B, Wright WE, Shay JW. Cell biology of disease: telomeropathies: an emerging spectrum disorder. J Cell Biol. 2014;205:289–299. ■ Yang K, Weinacht CP, Zhuang Z. Regulatory role of ubiquitin in eukaryotic DNA translesion synthesis. Biochemistry. 2013;52:3217–3228.

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CAPÍTULO 4

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Pruebas clínicas basadas en el ADN o el ARN Sinopsis ■ Las pruebas basadas en el ADN y el ARN se utilizan mucho en la práctica clínica, por ejemplo para el diagnóstico prenatal, el diagnóstico de enfermedades hereditarias, el cribado de microorganismos infecciosos y la optimización del tratamiento del cáncer. ■ Para la determinación citogenética tradicional del cariotipo (el conjunto de cromosomas) se cultivan in vitro células procedentes de una muestra de biopsia y se interrumpe la mitosis. Después se tiñen los cromosomas y se analizan con microscopia óptica. ■ En la hibridación fluorescente in situ (FISH, fluorescence in situ hybridization) se hibridan cromosomas con sondas de ADN marcadas con un colorante fluorescente. La principal aplicación de la FISH es la detección de alteraciones cromosómicas. ■ En la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) se utilizan cebadores de ADN sintéticos para definir un segmento de ADN que después se amplifica, a veces en un factor de más de 109. ■ Las micromatrices de ADN están formadas por una superficie inerte en la que se depositan en lugares conocidos numerosas secuencias conocidas de ADN. La hibridación del ADN en estudio o del ADN en estudio más un ADN competidor control, seguida por su detección, permite analizar el ADN en estudio para detectar deleciones, duplicaciones y, en casos especiales, incluso determinar la secuencia. Hay una gran variación en la capacidad de resolución de las pruebas basadas en micromatrices de ADN. ■ El secuenciado de Sanger es el método tradicional para secuenciar ácidos nucleicos. Más recientemente, el secuenciado paralelo masivo ha revolucionado el diagnóstico molecular; se utiliza, por ejemplo, para detectar mutaciones hereditarias y analizar mutaciones en un tumor. ■ El ADN procedente de la placenta circula en la sangre de la embarazada y se puede analizar mediante secuenciado paralelo masivo para estimar la dotación cromosómica del feto.

Objetivos de aprendizaje 109

Para dominar este tema, debería ser capaz de hacer lo siguiente: ■ Describir los requisitos de la muestra para un análisis citogenético tradicional y el nivel de detalle que puede esperarse en el informe final del cariotipo. ■ Describir la técnica FISH y explicar los resultados que pueden esperarse. ■ Explicar el mecanismo por el cual la PCR puede amplificar uno o más fragmentos de ADN específicos. Describir la PCR cuantitativa (en tiempo real). Explicar cómo se utiliza el ciclo umbral para la cuantificación del ADN en estudio. ■ Explicar cómo se pueden usar las enzimas de restricción y la electroforesis capilar para determinar la presencia o ausencia de una mutación. ■ Explicar cómo se puede emplear el análisis de la curva de fusión del ADN para determinar la presencia o ausencia de una mutación. ■ Describir el tipo de resultado que se puede esperar de una prueba de hibridación genómica comparativa matricial (aCGH, array comparative genomic hybridization) y de micromatrices de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, single nucleotide polymorphism) de ADN. ■ Comparar y contrastar el secuenciado de Sanger y el secuenciado paralelo masivo. ■ Explicar cómo se puede utilizar el ADN de la sangre de una embarazada para estimar el cariotipo de su feto.

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1. Citogenética convencional e hibridación fluorescente in situ En la citogenética convencional se cultivan in vitro células viables de biopsias tisulares, sangre o médula ósea y se interrumpe la mitosis en metafase cuando los cromosomas están máximamente condensados y claramente separados unos de otros. Los resultados del análisis de los cromosomas teñidos se resumen en un informe de cariotipo. En el caso de la FISH se permite que una o más sondas de ácidos nucleicos de loci genéticos de interés marcadas con un colorante fluorescente se hibriden con ácidos nucleicos que se han transformado en monocatenarios. Después se evalúan las manchas fluorescentes para detectar recombinaciones. Para el análisis citogenético tradicional y la determinación del cariotipo se cultivan in vitro células viables de un feto o un paciente, se interrumpe la mitosis en metafase (cuando los cromosomas están condensados), se vierten en un portaobjetos de vidrio, se tiñen y se analizan para detectar alteraciones, analizando el patrón de bandas específico de cada tipo de cromosoma (fig. 4.1; v. también fig. 1.12). Por lo tanto, las células utilizadas para los análisis citogenéticos deben ser capaces de dividirse y estar libres de infecciones. El colorante cromosómico más utilizado es el de Giemsa, en una técnica denominada bandeo cromosómico G o bandeo cromosómico de Giemsa. Las dos indicaciones más frecuentes para determinar el cariotipo son el cáncer y el diagnóstico prenatal.

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FIG. 4.1

Cariograma anormal de una célula de la médula ósea de un paciente con leucemia mieloide aguda. Las células de la médula ósea adquirieron una tercera copia del cromosoma 8 (flecha). (Por cortesía del Dr. Barry L. Barnoski, Oncocytogenetics Laboratory, Cooper University Hospital, Camden, NJ.)

La aneuploidía es la presencia de un número de cromosomas que no es un múltiplo exacto de 23, como 45 cromosomas en lugar de los 46 presentes en el cariotipo diploide normal (v. fig. 4.1). Para poderse ver en un análisis citogenético del cariotipo, una deleción o una inserción debe medir al menos aproximadamente 5 millones de pares de bases (pb) de longitud. Para la FISH se hibridan los cromosomas en metafase o interfase de las células de un paciente con un segmento de ADN que es específico del locus genético de interés y está conjugado con una molécula fluorescente (fig. 4.2). La FISH en frotis de cromosomas en metafase permite determinar la localización de la señal en un cromosoma. La FISH de los cromosomas en interfase se realiza en células que no estén dividiéndose y, por lo tanto, se puede utilizar en cortes de tejidos histológicos, de manera que la señal de FISH se pueda correlacionar con las características histológicas. En las células que tienen un cariotipo normal se ven dos señales (manchas fluorescentes) por núcleo, una para cada uno de los genes de los dos autosomas. Si hay una duplicación parcial o completa de un cromosoma, o si el locus genético en estudio está amplificado, se ven más de dos señales. Por el contrario, la deleción del gen en estudio lleva a una reducción del número de señales. La FISH detecta deleciones mayores de aproximadamente 150.000 pb. En

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consecuencia, la FISH puede detectar microdeleciones y microduplicaciones, que tienen un tamaño de aproximadamente 1 a 3 millones de bases y no se pueden detectar con el bandeo cromosómico G de los cromosomas en metafase. La FISH no es suficientemente sensible para detectar mutaciones puntuales o deleciones pequeñas. Ofrece datos sobre células únicas.

FIG. 4.2

Ejemplo de hibridación fluorescente in situ con cromosomas en interfase. Se estudiaron células de cáncer de mama para determinar la presencia de factor de crecimiento epidérmico 2 (HER2). La sonda fluorescente roja se une a HER2, y la sonda fluorescente verde se une al centrómero del cromosoma 17. En una célula normal están presentes dos señales rojas y dos verdes. En los tumores que cumplen los criterios de amplificación de HER2, el número de señales rojas es ≥6/célula, o el número de señales rojas es ≥4/célula y el cociente de señales rojas a verdes es ≥2. La imagen muestra el núcleo de una sola célula (azul). HER2 está amplificado. (Datos de Pu X, Shi J, Li Z, Feng A, Ye Q. Comparison of the 2007 and 2013 ASCO/CAP evaluation systems for HER2 amplification in breast cancer. Pathol Res Pract. 2015;211:421-425.)

La FISH también se puede emplear para detectar recombinaciones intra- e intercromosómicas (p. ej., translocaciones). La recombinación puede causar separación o fusión de dos sondas de FISH de colores diferentes para dos loci genéticos diferentes.

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2. Amplificación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa La PCR se utiliza para amplificar determinados segmentos de ADN de una muestra de ADN. Los cebadores determinan el comienzo y el final de una secuencia que se va a amplificar. En el laboratorio clínico la PCR se utiliza con frecuencia para determinar la cantidad de un ADN particular en una muestra, pero la técnica también tiene otras aplicaciones (v. secciones 3 y 4). La PCR es una técnica de amplificación con plantilla usada con frecuencia en pruebas clínicas para analizar ARN o ADN. La PCR produce múltiples copias de un segmento de ADN que está delimitado por dos secuencias de oligonucleótidos elegidas específicamente llamadas cebadores (fig. 4.3). Los cebadores de oligonucleótidos (ADN monocatenarios de aproximadamente 15 a 20 nucleótidos de longitud sintetizados in vitro) son necesarios para que se active la ADN polimerasa. Como se muestra en el capítulo 1, las cadenas de ADN complementarias se muestran por convención con el extremo 5′ de la cadena codificante en la parte superior izquierda. En esta representación, los dos cebadores a veces se denominan cebador directo y cebador inverso.

FIG. 4.3 Síntesis de ADN in vitro dirigida por cebador. El cebador directo utiliza la cadena inferior como plantilla y así sintetiza una nueva cadena superior. El cebador inverso utiliza la cadena superior como plantilla y así sintetiza una nueva cadena inferior.

Un ciclo de PCR supone la desnaturalización mediante calor para separar las cadenas de ADN complementarias, el enfriamiento para permitir la hibridación (fusión) de los cebadores con las secuencias complementarias de la plantilla y un calentamiento moderado para aumentar la actividad de la ADN polimerasa, que prolonga los cebadores utilizando la cadena de ADN

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hibridada como plantilla (fig. 4.4). Para simplificar la amplificación del ADN se elige una ADN polimerasa tolerante al calor (habitualmente de un organismo que vive en una fuente termal caliente). Un ciclo de PCR completo habitualmente tarda de 1 a 2 minutos.

FIG. 4.4

Principio de la amplificación mediante PCR de una secuencia de ADN. La PCR necesita dos cebadores diferentes para que se puedan amplificar las dos cadenas con un comienzo y un final de la secuencia definidos. La ADN polimerasa se obtiene de un organismo adaptado a temperaturas elevadas.

Después de 20 y 30 ciclos de PCR, la molécula de ADN matriz se ha copiado aproximadamente de 1 millón (220) a 1.000 millones (230) de veces, respectivamente. En este momento, el ADN no amplificado (el ADN que no es de interés) se ha desvanecido hasta una abundancia de fondo no significativa.

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En la PCR mediante retrotranscripción (RT-PCR), una plantilla de ARN se retrotranscribe a ADN complementario (ADNc), que después se amplifica como en la PCR habitual. PCR múltiple se refiere a una técnica en la cual se usan más de dos cebadores, de manera que se puede amplificar simultáneamente más de una secuencia de ADN (o ADNc). La PCR múltiple se puede utilizar para analizar varias regiones de interés al mismo tiempo (una de estas regiones se puede utilizar para el control de calidad). Después de la amplificación mediante PCR, el segmento de ADN amplificado (amplicón) se analiza con más detalle, muchas veces mediante uno de los métodos descritos en las secciones 3 y 4. El manejo de los amplicones para su análisis posterior conlleva riesgo de contaminación debido a la muy elevada concentración del amplicón en comparación con el segmento de ADN de interés en las muestras de pacientes. Muchos laboratorios realizan los pasos de pre- y postamplificación en áreas separadas. Para la PCR en tiempo real se añaden a la reacción sondas marcadas con un colorante fluorescente que son específicas para la secuencia de interés, y la fluorescencia se mide en cada uno de los ciclos de PCR (fig. 4.5). Esta tecnología a menudo se utiliza para la cuantificación y a veces se denomina PCR cuantitativa (qPCR). Se establece un umbral de fluorescencia y se ajusta una curva de calibración (fig. 4.6) que relaciona el ciclo umbral (es decir, el ciclo en el que la fluorescencia alcanza el umbral) con la cantidad de ADN matriz. Esto permite la cuantificación del ADN matriz en las muestras de los pacientes. Como la PCR en tiempo real ofrece los resultados directamente durante la realización de la prueba, no es necesaria la manipulación de los amplicones después de la PCR, lo que reduce significativamente el riesgo de contaminación.

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FIG. 4.5 Amplificación mediante PCR cuantitativa. La cantidad de ADN en la muestra aumenta exponencialmente, y se sigue con un colorante fluorescente en todos los ciclos. El ciclo en el que la cantidad de ADN supera el umbral predeterminado es una medida de la cantidad de ADN en la muestra inicial.

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FIG. 4.6

Curva estándar para la PCR en tiempo real que relaciona la concentración del analito con el ciclo umbral. La figura 4.5 explica el ciclo umbral. Cuanto mayor sea el ciclo umbral para una muestra, menor será la concentración del analito.

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3. Electroforesis y análisis de la curva de fusión del ADN La electroforesis permite la determinación del tamaño de un fragmento de ácido nucleico. La digestión con enzimas de restricción permite el análisis con sondas de una pequeña parte de la secuencia de un segmento de ADN. Las curvas de fusión permiten detectar una diferencia entre las secuencias de ADN que coinciden perfectamente con una sonda y las que coinciden de forma imperfecta. Todas estas pruebas se realizan habitualmente en ADN amplificado mediante PCR. La electroforesis se utiliza habitualmente para la separación por tamaño de fragmentos de ácidos nucleicos. Un campo eléctrico arrastra las moléculas con carga negativa a lo largo de una matriz, como un gel de agarosa o poliacrilamida, o un tubo capilar relleno con un polímero. Las moléculas de ADN pequeñas son las que más rápidamente emigran porque son las que menor arrastre experimentan en la matriz; por el contrario, las moléculas de ADN grandes son las que más lentamente emigran. La electroforesis capilar se utiliza en el moderno secuenciado de Sanger (fig. 4.10) y para determinar la longitud del fragmento después de la PCR o de la digestión con una enzima de restricción (v. más adelante). La digestión con enzimas de restricción (endonucleasas de restricción) del ADN amplificado mediante PCR permite obtener información limitada sobre una secuencia (fig. 4.7). Se dispone de centenares de enzimas de restricción que cortan solo en secuencias específicas (que son en su mayor parte palindrómicas, es decir, se leen igual en las dos cadenas de ADN) y de una manera específica. Es probable que se pueda encontrar una enzima de restricción que corte solo la secuencia normal o la secuencia mutante conocida. Después del final de la reacción, el tamaño de los productos se determina mediante electroforesis.

FIG. 4.7

Digestión con una enzima de restricción de ADN amplificado

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mediante PCR. Después de la digestión con la enzima de restricción, la longitud del fragmento de ADN se determina mediante electroforesis. Esta técnica se puede emplear, por ejemplo, para detectar la mutación C282Y en el gen HFE de pacientes en los que se sospecha hemocromatosis por HFE (v. sección 9.2 en cap. 15).

En lugar de la digestión con una enzima de restricción se puede utilizar el análisis de la curva de fusión mediante PCR en tiempo real (fig. 4.8) para identificar pequeñas variaciones de una secuencia conocida. La PCR en tiempo real se realiza con los cebadores habituales y también con dos sondas de ácidos nucleicos marcadas y específicas de secuencia. A una temperatura baja, una de las dos sondas se fusiona con el segmento en el que está localizada la mutación conocida, independientemente de la presencia o ausencia de la mutación. La sonda que se fusiona más cerca del extremo del segmento 5′ del ADN amplificado tiene un cromóforo donante en el extremo 3′, y la segunda sonda (que se hibrida directamente con la primera sonda) tiene un cromóforo aceptador en el extremo 5′. Cuando las dos sondas se unen al ADN amplificado, una cerca de la otra, y cuando se las ilumina con la luz que absorbe con eficiencia el cromóforo donante, tiene lugar la transferencia de energía de resonancia de Förster al cromóforo aceptador. Después, el cromóforo aceptador emite fluorescencia a su longitud de onda específica, que se mide con el instrumento de PCR en tiempo real. Al final de los ciclos de amplificación se fusionan las sondas, y la intensidad de la fluorescencia es elevada. Después se calienta gradualmente la muestra, lo que hace que las sondas se separen del ADN amplificado. Si la sonda no coincide perfectamente con el ADN del paciente, se disocia a una temperatura relativamente baja, lo que lleva a que se pierda la fluorescencia. Por el contrario, la sonda que se hibrida perfectamente con el ADN del paciente se disocia a una temperatura relativamente elevada. Para la interpretación, la curva de fusión del ADN en estudio se compara con un patrón.

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FIG. 4.8

Análisis de la curva de fusión.

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4. Tecnologías basadas en micromatrices de ADN Las micromatrices de ADN contienen secuencias de ADN conocidas en localizaciones conocidas y se pueden utilizar para analizar el ADN en estudio para detectar deleciones y duplicaciones y, en un número escaso de localizaciones elegidas, para determinar la secuencia. Una micromatriz de ADN (a veces denominada chip) está formada por una superficie plana tratada (a menudo de vidrio) de aproximadamente 25 × 25 mm2 de tamaño en la que se han imprimido densamente varias copias, cada una de miles a más de 1 millón de segmentos diferentes de ADN (a menudo denominados sondas). Se conoce la secuencia de cada una de las sondas, igual que su localización en la matriz. Se permite que el ADN en estudio (y a veces el ADN control) se hibride con las sondas y después se mide la magnitud de la hibridación. Dependiendo de la longitud, diversidad y diseño de las sondas de una micromatriz de ADN, se consiguen diferentes resoluciones y objetivos. Las sondas más largas se unen a los fragmentos de ADN independientemente de una variación menor en la secuencia. Esto se utiliza para rastrear todo el genoma para detectar variaciones en el número de copias (VNC; es decir, deleciones o amplificaciones; v. hibridación genómica comparativa basada en matrices, más adelante). No se pueden detectar translocaciones balanceadas porque el ADN se fragmenta antes de su análisis. Las sondas más cortas se pueden diseñar para diferenciar entre secuencias cortas que difieren en un único nucleótido (v. micromatrices de polimorfismos de un solo nucleótido, más adelante). En una de las aplicaciones clínicas más frecuentes, la aCGH, las micromatrices se exponen simultáneamente a fragmentos de ADN control marcado con un fluoróforo particular y a fragmentos de ADN en estudio marcados con un fluoróforo diferente (fig. 4.9). Los fragmentos de ADN en estudio y control compiten por la hibridación con sondas complementarias en la micromatriz. Se determina la fluorescencia de cada uno de los fluoróforos para cada una de las localizaciones de la matriz impresas. En cada una de las localizaciones, el cociente de la fluorescencia de los dos fluoróforos indica el cociente de ADN en estudio respecto al ADN control.

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FIG. 4.9 Análisis de micromatrices del cromosoma 1. La parte más izquierda de la figura muestra un esquema del cromosoma 1. Cada punto del gráfico representa la lectura de una sonda de oligonucleótidos. En el área que no muestra puntos (aproximadamente el centrómero, y de q12 a q21.1) no había sondas de oligonucleótidos. Los números del eje horizontal se refieren a los números de segmentos de ADN perdidos o ganados en relación con el ADN control. Los datos corresponden a un recién nacido con una malformación cerebral. (De Peters DG, Yatsenko SA, Surti U, Rajkovic A. Recent advances of genomic testing in perinatal medicine. Semin Perinatol. 2015;39:44-54.)

Las micromatrices de SNP de ADN están diseñadas para determinar la identidad de nucleótidos únicos en miles de loci específicos del genoma. Un SNP es un locus del genoma en el que se encuentra frecuentemente una diferencia de una única base (A, C, G o T) en la población. Los SNP son tan polimorfos (variados) en la población que es probable que las personas hereden dos versiones diferentes del SNP de sus progenitores. La matriz incluye sondas para las dos cadenas de ADN y para todos los SNP importantes. El ADN de un paciente, marcado con un colorante fluorescente, se hibrida con la matriz de SNP y se une sobre todo a las sondas de la matriz que son perfectamente complementarias.

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Las matrices de SNP se pueden utilizar para identificar variaciones en la secuencia de los SNP, comparar la distribución de los SNP en personas emparentadas y realizar análisis de ligamiento, y determinar los puntos de pérdida de la heterocigosidad. Los segmentos afectados por pérdida de la heterocigosidad contienen numerosos SNP. Si hay pérdida de la heterocigosidad (v. sección 4.2 en cap. 2), segmentos de SNP vecinos pierden su diversidad natural (por la pérdida no compensada de un segmento de ADN o por reparación del ADN por recombinación homóloga). En la práctica clínica a menudo se combinan las matrices de aCGH y de SNP.

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5. Secuenciado del ADN El secuenciado de Sanger es una forma muy precisa, pero lenta y costosa, de secuenciar el ADN con nucleótidos finalizadores de la cadena. El secuenciado paralelo masivo se utiliza mucho en diagnóstico molecular. Supone unir fragmentos de ADN a una superficie, multiplicarlos a escala local y después secuenciarlos en su localización conocida. Con algoritmos, los datos de la secuencia se ensamblan para obtener un genoma (similar a un rompecabezas).

5.1. Secuenciado de Sanger El secuenciado de Sanger se basa en el principio de que la ADN polimerasa que sintetiza el ADN puede incorporar un didesoxinucleótido, lo que produce finalización de la cadena (los didesoxinucleótidos carecen de un grupo hidroxilo en posición 3′ que pueda formar un enlace fosfodiéster con un nucleótido entrante; v. fig. 3.2). Si una mezcla contiene aproximadamente el 99% de desoxinucleótidos normales y aproximadamente el 1% de didesoxinucleótidos finalizadores de la cadena, una cadena finaliza siempre que se incorpora un didesoxinucleótido. Habitualmente, los cuatro diferentes didesoxinucleótidos finalizadores de la cadena (A, T, C y G) se marcan con cuatro colorantes fluorescentes diferentes, lo que genera fragmentos de ADN que emiten fluorescencia con el color que corresponde al nucleótido del extremo 3′ de la cadena. La separación de las cadenas resultantes con una resolución de una base (que ahora generalmente se hace mediante electroforesis capilar; v. sección 3) y la detección de los cuatro colores diferentes de la fluorescencia permite determinar la secuencia de los nucleótidos (v. fig. 4.10).

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FIG. 4.10 Resultado del secuenciado de Sanger de un nódulo pulmonar. El nódulo contenía algunas células que tenían una secuencia BRAF normal con el pico rojo esperado, lo que indica que corresponde a una T (se muestra la quinta base, flecha roja), y células que contenían una mutación T→A, que se ve como un pico verde de menor tamaño en el mismo lugar. (De Yousem SA, Dacic S, Nikiforov YE, Nikiforova M. Pulmonary Langerhans cell histiocytosis: profiling of multifocal tumors using next-generation sequencing identifies concordant occurrence of BRAF V600E mutations. Chest. 2013;143:1679-1684.)

5.2. Secuenciado paralelo masivo Secuenciado paralelo masivo (secuenciado de segunda generación, secuenciado de próxima generación o secuenciado profundo) se refiere al secuenciado masivo de múltiples segmentos de ADN. Actualmente esto se realiza fragmentando el ADN, enriqueciéndolo en las regiones de interés, creando una biblioteca de ADN unida a un soporte sólido y después secuenciando los fragmentos de ADN unidos en su localización específica paso a paso, mientras se sigue la reacción con técnicas de imagen. Se dispone de múltiples tecnologías diferentes. Después del secuenciado paralelo masivo, las secuencias obtenidas (lecturas) se ensamblan en cromosomas completos utilizando algoritmos informáticos (fig. 4.11) que aprovechan la superposición de las secuencias y el

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conocimiento del genoma humano. Para el estudio genético (cuando se espera que todas las células estudiadas sean genéticamente idénticas) deben hacerse 30 o más lecturas. Cuando se buscan mutaciones somáticas en tumores, la profundidad del secuenciado puede ser de hasta 1.000 lecturas, lo que permite detectar una mutación en tan solo aproximadamente el 5% de las células.

FIG. 4.11 Resultados procesados del secuenciado en paralelo masivo. Las flechas indican la dirección de las cadenas secuenciadas (el ADN tiene dos cadenas complementarias antiparalelas). Los fragmentos con flechas que señalan hacia la parte más izquierda o derecha del gráfico se extienden más allá del marco mostrado. La máxima profundidad de lectura para el segmento de 100 bases que se muestra es 24.

Cuando se busca una alteración genética, el secuenciado de próxima generación puede cubrir todo el genoma (secuenciado pangenómico) o estar limitado a todos los exones (secuenciado del exoma). El exoma constituye solo el ∼2% del genoma, aunque contiene el ∼85% de todas las mutaciones causantes de enfermedad. El coste de secuenciar el ∼95% del exoma es actualmente el ∼10% del coste de secuenciar el ∼98% de todo el genoma. Para el secuenciado se dispone de paneles de mutaciones de puntos calientes que abarcan hasta varios centenares de segmentos de ADN en los que se sabe que se producen mutaciones. Estos paneles se pueden utilizar para determinar el espectro de mutaciones significativas en un tumor o para elucidar la base genética del trastorno hereditario de un paciente. Actualmente el desafío no es tanto la generación de datos para el

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secuenciado a un precio asequible y una velocidad razonable, sino la conservación y la interpretación de estos datos, que son muy complejos. Por ejemplo, el secuenciado del exoma del ADN de un solo paciente permite obtener aproximadamente 25.000 variantes, y el secuenciado del genoma del mismo ADN permite obtener aproximadamente 3 millones de variantes. Es difícil separar las variantes con importancia clínica de las variantes de significado desconocido (VSD). Además, es difícil determinar qué datos se deben revelar, y cómo se debe explicar a los pacientes individuales esta compleja información.

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6. Aplicaciones clínicas seleccionadas de las pruebas basadas en el ADN Las pruebas basadas en el ADN se utilizan mucho en el diagnóstico prenatal, para determinar la causa de las infecciones, en el diagnóstico de determinados trastornos hereditarios y para evaluar los tumores a fin de detectar alteraciones genéticas relacionadas con el diagnóstico, el pronóstico o el tratamiento.

6.1. Diagnóstico prenatal Se utilizan varios métodos para el estudio prenatal: proteínas en el suero de la madre (cribado triple, cribado cuádruple, cribado quíntuple; v. sección 2.3 en cap. 31), exploración ecográfica del feto y análisis del ADN del feto. Aproximadamente el 1-2% de los fetos son aneuploides, y otro 3-4% tienen una microdeleción o microduplicación. Las principales aneuploidías son: trisomía 13 (síndrome de Patau), trisomía 18 (síndrome de Edwards), trisomía 21 (síndrome de Down), síndrome de Turner (solo un cromosoma X) y síndrome de Klinefelter (XXY). Los fetos con la mayor parte de las demás aneuploidías no son viables. Los principales síndromes de microdeleción son: microdeleción en el brazo largo del cromosoma 7 que produce síndrome de Williams; un error de impronta o microdeleción en una región del brazo largo del cromosoma 15, cerca del centrosoma, que causa síndrome de Prader-Willi o de Angelman, y microdeleción en el brazo largo del cromosoma 22, cerca del centrosoma, que causa síndrome de DiGeorge en su manifestación más grave. Se puede obtener ADN sintetizado por el feto extrayendo líquido amniótico (amniocentesis), tomando una biopsia de las vellosidades coriónicas (muestreo de vellosidades coriónicas) u obteniendo una muestra de sangre de la madre. Las técnicas invasivas para la obtención de muestras de líquido amniótico y de vellosidades coriónicas se asocian a un riesgo de aborto espontáneo del ∼1%. La obtención de una muestra de sangre de una embarazada para analizar el ADN acelular no conlleva este riesgo, aunque el análisis de este ADN es mucho menos sensible y más complicado. Las células fetales obtenidas del líquido amniótico o de muestras de vellosidades coriónicas se pueden cultivar, detener en metafase, teñir y analizar mediante bandeo cromosómico G (v. sección 1). El bandeo cromosómico G identifica fácilmente aneuploidías, pero no microdeleciones. Las sondas de FISH pueden detectar las aneuploidías más frecuentes, y también se utilizan para encontrar o confirmar microdeleciones y microduplicaciones. Una combinación de micromatrices de aCGH y micromatrices de SNP de ADN fetal descubre las mismas aneuploidías y alteraciones cromosómicas no balanceadas que el bandeo cromosómico G,

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aunque no puede detectar translocaciones balanceadas ni triploidías (v. también sección 4). Sin embargo, esta tecnología de micromatrices combinadas revela disomía uniparental (v. sección 4.2 en cap. 2) y descubre pequeños cambios cromosómicos que quedan por debajo del nivel de resolución del bandeo cromosómico G. Actualmente se desconoce la importancia clínica de una elevada proporción de estas alteraciones pequeñas. Los fragmentos de ADN fetal menores de 200 pb de longitud circulan brevemente en la sangre de la embarazada. Estos fragmentos de ADN fetal también se denominan ADN fetal acelular. El ADN se origina en la placenta. El tamaño máximo del ADN fetal acelular es de aproximadamente 140 pb, y el del ADN materno acelular es de aproximadamente 160 pb. Los fragmentos de ADN materno corresponden al ADN de un nucleosoma más un conector, mientras que el ADN fetal carece de la secuencia conectora (debe de haberse recortado). A las 10-20 semanas de gestación, el suero de la madre contiene aproximadamente 10 veces más ADN de la madre que del feto. Después del parto, la concentración de ADN fetal en el plasma de la madre disminuye rápidamente porque la semivida del ADN fetal es de tan solo aproximadamente 15 minutos. Cuando se utiliza suero de la madre embarazada hay varios métodos para determinar las alteraciones del ADN fetal en el mar del ADN materno. En un método se secuencia todo el ADN de la madre mediante secuenciado paralelo masivo. Después se ensamblan los fragmentos de ADN con algoritmos informáticos para obtener cromosomas completos. Si el feto tiene una trisomía (p. ej., trisomía 21, que da lugar a síndrome de Down y que aparece en aproximadamente 1 de cada 750 embarazos), se observa mayor número de cromosomas 21 que de otros cromosomas. El secuenciado paralelo masivo a menudo está limitado a los cromosomas con más importancia clínica. Otro método es el secuenciado del genoma del padre. La máxima utilidad del secuenciado del ADN acelular en el plasma de la madre es la detección de aneuploidías. Para determinar la dotación de cromosomas sexuales del feto a menudo se utilizan una o más de las técnicas ya mencionadas. Esto tiene una importancia especialmente elevada en familias afectadas por trastornos ligados al cromosoma X (p. ej., síndrome de Lesch-Nyhan; v. sección 2.4 en cap. 38) o por hiperplasia suprarrenal congénita (v. sección 4.2 en cap. 31). El ADN acelular también se puede utilizar fácilmente para estudiar la positividad de los antígenos D de rhesus en el feto de una madre negativa para estos antígenos. En esta situación se precisa el tratamiento de la madre con inmunoglobulina anti-D de rhesus.

6.2. Otras pruebas basadas en ácidos nucleicos de uso habitual Para guiar el tratamiento del cáncer, algunas compañías ofrecen una

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combinación de bioinformática y secuenciado paralelo masivo de alteraciones genéticas conocidas en las células tumorales. Algunos ejemplos de estas pruebas son: FoundationOne, FoundationOne Heme y Caris Molecular Intelligence. El secuenciado paralelo masivo de fragmentos de ADN seleccionados también está disponible para enfermedades hereditarias que pueden estar causadas por una mutación de uno de múltiples genes, como cáncer de mama hereditario (v. sección 4.2 en cap. 2), síndrome de Lynch (una forma de cáncer de colon hereditario; v. sección 2 en cap. 2) o diabetes neonatal (v. secciones 1 y 3 en cap. 39). El diagnóstico de muchos microorganismos infecciosos se realiza mediante PCR en tiempo real. La identificación de los microorganismos infecciosos basada en el ADN o el ARN es mucho más rápida que las técnicas en las que se debe realizar un cultivo. Además, no todos los microorganismos infecciosos se pueden cultivar. Una reducción del tiempo hasta la obtención de los resultados es especialmente importante en pacientes de cuidados intensivos que tienen infecciones potencialmente mortales. El análisis molecular rápido para detectar patógenos se puede realizar en 1-2 horas. El estudio de la carga vírica es importante para monitorizar la eficacia del tratamiento de las infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis C y otras infecciones víricas. En la práctica ginecológica hay pruebas moleculares de uso habitual para detectar el ARN de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y Trichomonas vaginalis, así como el ADN del virus del herpes simple. La detección del ADN o del ARN mensajero (ARNm) del virus del papiloma humano es importante para determinar qué pacientes tienen mayor riesgo de cáncer cervical. Las leucemias y los linfomas se clasifican con una frecuencia cada vez mayor por sus alteraciones genéticas para guiar el diagnóstico y el tratamiento. Por ejemplo, la leucemia mielógena crónica y algunas formas de leucemia linfoide aguda están causadas por una translocación recíproca entre los cromosomas 9 y 22, lo que lleva a la síntesis de una proteína de fusión BCR-ABL1 patógena. Se dispone de tratamientos que bloquean la actividad cinásica de la proteína de fusión. Después de iniciar el tratamiento se cuantifica cada pocos meses la cantidad de ARNm de BCR-ABL1 mediante RT-PCR (v. sección 2) para monitorizar la eficacia del tratamiento.

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Resumen ■ El estudio citogenético tradicional necesita células estériles que se puedan cultivar in vitro. El estudio citogenético puede detectar todas las alteraciones en el número de cromosomas, así como deleciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones mayores de aproximadamente 5 millones de pb. ■ La hibridación fluorescente in situ (FISH) es ideal para detectar deleciones y amplificaciones de segmentos de ADN de más de aproximadamente 150.000 pb, como la amplificación del gen HER2 (factor de crecimiento epidérmico 2) en el cáncer de mama. La FISH también se utiliza para la identificación rápida de translocaciones e inversiones. ■ En la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los cebadores directo e inverso determinan los extremos 5′ y 3′ del amplicón. Con cada ciclo de temperatura el ADN se fusiona, los cebadores se unen, y la ADN polimerasa termoestable prolonga los cebadores. En la PCR cuantitativa (qPCR) se obtiene información cuantitativa del número del ciclo umbral en relación con una curva de calibración. En la PCR múltiple hay múltiples cebadores directos e inversos. En la PCR con retrotranscripción (RT) primero se retrotranscribe el ARN a ADN y después se amplifica mediante PCR. ■ La electroforesis capilar se utiliza mucho en pruebas clínicas para determinar el tamaño de los fragmentos de ADN. ■ El análisis de la curva de fusión ofrece información sobre errores de emparejamiento de secuencias en comparación con una sonda elegida. La digestión con enzimas de restricción es otro método para estudiar la presencia de una mutación puntual patógena en un amplicón. ■ La hibridación genómica comparativa matricial (aCGH) y las micromatrices de ADN de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) impresas con oligonucleótidos pueden ofrecer información detallada sobre aneuploidías, microdeleciones, microduplicaciones y disomía uniparental, pero no sobre translocaciones balanceadas. ■ El secuenciado de Sanger se basa en la finalización de la cadena inducida por los didesoxinucleótidos, seguida por electroforesis (habitualmente electroforesis capilar). ■ El secuenciado paralelo masivo consiste en la unión de fragmentos de ADN del genoma a un soporte sólido y, después, el seguimiento de la reacción de secuenciado en la superficie del soporte. Los fragmentos de la secuencia de ADN se ensamblan mediante algoritmos informáticos. ■ Las células obtenidas mediante amniocentesis o muestreo de las

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vellosidades coriónicas se pueden analizar mediante bandeo cromosómico G, FISH, aCGH, micromatrices de SNP en el ADN o secuenciado paralelo masivo. ■ Mediante secuenciado paralelo masivo se pueden diferenciar pequeños segmentos de ADN fetal del ADN acelular de la madre en la sangre de una embarazada, y se pueden utilizar para descubrir la aneuploidía del feto, además de determinar la dotación de cromosomas sexuales del feto. ■ Se dispone de secuenciado paralelo masivo de segmentos de ADN seleccionados para caracterizar alteraciones genéticas en tumores. ■ Los microorganismos infecciosos a menudo se cuantifican mediante métodos moleculares, a veces después de la retrotranscripción del ARN a ADNc.

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Lecturas recomendadas ■ Moorthie S, Mattocks CJ, Wright CF. Review of massively parallel DNA sequencing technologies. Hugo J. 2011;5:1–12. ■ Peters DG, Yatsenko SA, Surti U, Rajkovic A. Recent advances of genomic testing in perinatal medicine. Semin Perinatol. 2015;39:44–54. ■ Szuhai K, Vermeer M. Microarray techniques to analyze copy-number alterations in genomic DNA: array comparative genomic hybridization and single-nucleotide polymorphism array. J Invest Dermatol. 2015;135:e37. ■ Wong AI, Lo YM. Noninvasive fetal genomic, methylomic, and transcriptomic analyses using maternal plasma and clinical implications. Trends Mol Med. 2015;21:98–108.

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CAPÍTULO 5

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Genética básica para bioquímica Sinopsis ■ Este capítulo explica algunos términos básicos en genética que se utilizan en este libro. Aborda únicamente los aspectos fundamentales relevantes y recurrentes, y no se pretende que constituya una introducción a la genética. ■ Las células humanas nucleadas normales tienen 46 cromosomas, la mitad de los cuales se heredan de la madre y la mitad del padre. En cada uno de los progenitores, durante la meiosis, estos cromosomas se vuelven a ensamblar a partir de los cromosomas ya existentes mediante un proceso de múltiples fenómenos de entrecruzamiento genético. ■ Una persona que es homocigota para una secuencia de ADN particular (p. ej., un gen) tiene dos copias exactas de la secuencia, mientras que una persona que es heterocigota tiene dos copias diferentes. ■ Las enfermedades ligadas a X habitualmente aparecen con mayor frecuencia en hombres que en mujeres. En fases tempranas del desarrollo de una mujer, cada célula elige aleatoriamente un cromosoma X para su inactivación. Cada célula después da lugar a células hijas que mantienen la inactivación del mismo cromosoma X. En consecuencia, las mujeres son mosaicos en relación con los cromosomas X que expresan. ■ En cada ovocito, al igual que en cada espermatozoide, un pequeño conjunto de genes presenta impronta (imprinting), de manera que estas copias maternas y paternas de los genes no se expresan en la descendencia. ■ A menudo se analiza la asociación entre enfermedad y pequeñas diferencias de secuencia en localizaciones conocidas del genoma con la esperanza de elucidar la base genética de una enfermedad.

Objetivos de aprendizaje Para dominar este tema, debería ser capaz de hacer lo siguiente: ■ Describir el cariotipo humano normal y definir el concepto de aneuploidía. ■ Explicar los términos alelo, homocigosidad, heterocigosidad y heterocigosidad compuesta. ■ Comparar y contrastar la penetrancia y la expresividad variable. ■ Comparar y contrastar la herencia dominante y recesiva. Explicar el

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significado de los términos haploinsuficiencia, mutación con ganancia de función, mutación con pérdida de función y efecto negativo dominante y relacionar estos términos con la herencia dominante y recesiva. Mostrar un ejemplo de cada uno de estos términos. ■ Comparar y contrastar los fenotipos esperados de los trastornos ligados a X en hombres y mujeres. ■ Comparar y contrastar la herencia mendeliana con la herencia no mendeliana debida a impronta (imprinting). ■ Describir el patrón de herencia del ADN en las mitocondrias. ■ Explicar los términos células de la estirpe germinal y células somáticas. ■ Enumerar los tipos frecuentes de mutaciones. ■ Describir el uso de marcadores polimorfos en el análisis de ligamiento.

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1. Cromosomas y alelos Excepto en el caso de los cromosomas sexuales, los seres humanos sanos tienen dos copias de cada cromosoma. Las mitocondrias de una célula típica contienen 1.000 o más copias de su propio genoma. Una persona que es homocigota para un fragmento de ADN celular tiene dos copias idénticas de ese fragmento, y una persona que es heterocigota o heterocigota compuesta tiene dos copias diferentes. El núcleo normal de una célula humana contiene 46 cromosomas (es decir, dos copias de cada uno de los 22 autosomas y dos cromosomas sexuales) (XX o XY; v. cap. 1). La mitad de estos cromosomas proceden de la madre, y la otra mitad, del padre. Como una célula humana normal típica tiene dos copias de cada uno de los cromosomas (excepto posiblemente los cromosomas sexuales), se dice que es diploide (o 2n). Por el contrario, el ovocito y el espermatozoide normales son haploides (o 1n) (es decir, tienen solo 23 cromosomas [22 autosomas y 1 cromosoma sexual]). Una célula aneuploide tiene más o menos de 46 cromosomas. El cariotipo de las células es la descripción de la composición de sus cromosomas. Los cariotipos humanos normales son 46,XX y 46,XY (número de cromosomas, seguido por una descripción de los cromosomas sexuales). La figura 1.12 muestra una imagen de un cariotipo normal. La aneuploidía suele ser patógena. Los ejemplos incluyen síndrome de Down (tres copias del cromosoma 21; cariotipo: 47,XX, + 21 o 47,XY, + 21), síndrome de Turner (45,X) y síndrome de Klinefelter (47,XXY). Muchas células tumorales son aneuploides. Los cromosomas homólogos tienen una arquitectura similar, aunque se originan en progenitores diferentes. Por ejemplo, el cromosoma 1 heredado de la madre es homólogo al cromosoma 1 heredado del padre. La mayor parte de las células humanas contienen mitocondrias, que tienen su propio genoma en forma de ADN mitocondrial (ADNmt; v. cap. 23). Una célula típica contiene 1.000 o más copias de ADNmt en su red de mitocondrias (es decir, una mitocondria tiene múltiples copias del ADNmt). El ADNmt se hereda exclusivamente de la madre. La herencia del ADNmt y las enfermedades asociadas es compleja porque las mitocondrias pueden contener mezclas de diferentes ADNmt que se transmiten en una distribución aleatoria (v. sección 3 en cap. 23). Cada cromosoma contiene muchos genes. Un gen se suele definir como una región de ADN que se transcribe a ARN. Como tenemos dos copias de cada uno de los cromosomas, también tenemos dos copias de cada uno de los genes; estas dos copias se denominan alelos. Habitualmente tenemos un alelo heredado de la madre y otro del padre. Una persona homocigota tiene dos copias similares de un gen; pueden ser dos copias normales o dos copias patógenas. Una persona heterocigota tiene

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dos copias diferentes del mismo gen, por ejemplo una copia normal y otra patógena. Una persona heterocigota compuesta tiene dos copias anormales diferentes del mismo gen. Por ejemplo, una persona que sintetiza solo una fenilalanina hidroxilasa normal es homocigota para la fenilalanina hidroxilasa normal. Una persona que es portadora de fenilcetonuria tiene un alelo normal y otro anormal para la fenilalanina hidroxilasa. La persona que tiene dos copias mutantes patógenas idénticas de la enzima es homocigota para la carencia de fenilalanina hidroxilasa. Una persona que tiene dos alelos mutantes diferentes para la fenilalanina hidroxilasa (de la cual hay muchas mutantes diferentes en la población) es heterocigota compuesta para una fenilalanina hidroxilasa mutante. Las mujeres tienen dos cromosomas X, y los hombres tienen un cromosoma X y un cromosoma Y. Un hombre XY es hemicigoto para todos los alelos del cromosoma X.

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2. Impronta y patrones de herencia Los rasgos codificados por los cromosomas del núcleo muestran patrones de herencia dominante o recesiva, mientras que el tipo de herencia depende tanto de la definición del fenotipo como de la conducta de las moléculas relevantes. Una pequeña fracción de genes se expresa solo cuando se hereda de la madre o solo del padre debido a impronta (metilación del ADN). Los rasgos codificados por el ADNmt se heredan solo a través de la madre. El fenotipo describe los atributos de una persona. Puede incluir, por ejemplo, características físicas, conducta, mediciones de laboratorio o riesgo de neoplasias. Penetrancia se refiere a la frecuencia con la que un determinado genotipo causante de enfermedad produce la enfermedad. La penetrancia generalmente aumenta con la edad. La hemocromatosis (v. cap. 15), por ejemplo, tiene penetrancia incompleta porque solo un grupo de personas que tienen un gen HFE con la mutación C282Y presenta sobrecarga de hierro (p. ej., los hombres ancianos que abusan del alcohol y están infectados por el virus de la hepatitis C tienen una penetrancia muy elevada). Expresividad variable se refiere a los síntomas que se ven con una mutación particular. Por ejemplo, el síndrome de Marfan (v. cap. 13) se debe a una mutación de la fibrilina 1. En los familiares que tienen la misma mutación, la penetrancia puede ser del 100% (es decir, todos manifiestan claramente síndrome de Marfan), aunque puede haber una gran variación en el fenotipo. Por ejemplo, algunos familiares pueden tener el tórax normal, mientras que otros tienen tórax infundibuliforme que se debe corregir quirúrgicamente. En la herencia autosómica dominante el fenotipo está determinado por el alelo dominante. En la osteogénesis imperfecta, un alelo codifica un colágeno tipo I mutante que altera el ensamblado del colágeno tipo I para formar fibrillas (v. sección 2.2 en cap. 13). Este alelo es dominante (produce enfermedad por sí solo) y está en un autosoma. Por lo tanto, la osteogénesis por este alelo particular se hereda con un patrón autosómico dominante. La herencia autosómica dominante se puede deber a los siguientes fenómenos (se muestran ejemplos en la tabla 5.1): ■ Haploinsuficiencia: una única copia funcional de un gen no es suficiente para mantener una función normal. ■ Mutación con ganancia de función: una proteína adquiere una función patógena nueva (p. ej., actividad incontrolada, agregación o catálisis de una nueva reacción); también es posible que se sinteticen copias adicionales de un gen y se inserten en un cromosoma (proceso denominado duplicación génica o amplificación génica), o que un gen se transcriba a mayor velocidad. ■ Efecto negativo dominante: una proteína anormal destruye la

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función de la proteína normal. Esto a menudo se ve en proteínas que son activas en forma de dímeros, trímeros, tetrámeros y así sucesivamente.

Tabla 5.1 Ejemplos de los tipos de mutación que muestran herencia autosómica dominante

LDL, lipoproteína de baja densidad.

En la herencia autosómica recesiva el fenotipo está presente cuando hay dos alelos recesivos. Esto se observa con frecuencia en carencias de enzimas que actúan como monómeros. A menudo es suficiente la mitad de la actividad normal, pero una actividad menor del 10% de lo normal puede ser patógena. La consanguinidad de los progenitores a menudo da lugar en la descendencia a un trastorno autosómico recesivo por lo demás poco habitual. En genética la consanguinidad se refiere a una relación genética estrecha entre dos individuos. Dos familiares de primer grado (p. ej., un progenitor y un hijo, o dos hermanos) tienen un cociente de relación de 0,5. Dos familiares de segundo grado (p. ej., un niño y una tía o una abuela) tienen un coeficiente de relación de 0,25. Dos familiares de tercer grado (p. ej., dos primos carnales) tienen un coeficiente de relación de 0,125. Se debe tener en cuenta que el tipo de herencia (dominante recesiva) depende tanto de la definición del fenotipo o rasgo como de las características de las moléculas que participan en la generación del fenotipo. Aunque una enfermedad particular se hereda con un patrón recesivo en el 99% de las ocasiones, el 1% de todos los pacientes afectados pueden tener una mutación menos frecuente en el mismo gen que muestre herencia dominante. Por lo

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tanto, siempre hay excepciones a afirmaciones como «la enfermedad tiene herencia autosómica recesiva». Las mutaciones con pérdida de función (mutaciones inactivadoras) son la norma en los rasgos que presentan herencia autosómica recesiva. En los trastornos que muestran herencia ligada a X, los hombres están afectados siempre. Las mujeres heterocigotas están afectadas claramente en la herencia dominante ligada a X, aunque pueden no estar afectadas en la herencia recesiva ligada a X. Como sugirió en 1961 Mary Lyon (la hipótesis de Lyon), las mujeres inactivan todos los cromosomas X excepto uno de cada célula en el embrión de forma parcheada, proceso denominado compensación de dosis génica. Una célula inactiva el cromosoma X procedente del padre. Una célula vecina puede inactivar el mismo cromosoma X o el cromosoma X procedente de la madre en un proceso determinado totalmente por el azar. Estas primeras células dan lugar a una progenie que mantiene los mismos patrones de inactivación de X. Por lo tanto, las mujeres son mosaicos para la expresión del cromosoma X. Estadísticamente es muy probable que una mujer exprese el cromosoma X materno en el 50% de las células y el paterno en el otro 50%. Es menos probable que una mujer exprese en sus células los cromosomas X procedentes solo de un progenitor. Es posible que ocurra cualquier cosa entre estos dos extremos. Si la inactivación es desigual, se denomina inactivación de X sesgada. Por este motivo, un trastorno recesivo ligado a X puede producir fenotipos muy diferentes en las mujeres heterocigotas. Los ejemplos de trastornos ligados a X incluyen carencia de glucosa 6fosfato deshidrogenasa (v. cap. 21), carencia de ornitina carbamoiltransferasa (v. cap. 35) y enfermedad de Lesch-Nyhan (v. cap. 38). La inactivación del cromosoma X en las mujeres se produce mediante metilación del ADN. El cromosoma X inactivado está condensado durante todo el ciclo celular, y se puede ver en el núcleo en forma de corpúsculo de Barr (fig. 5.1).

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FIG. 5.1

Corpúsculo de Barr en los neutrófilos de una mujer.

Una persona es un mosaico genético si algunas células tienen un genoma claramente diferente del de otras células. El mosaicismo habitualmente es la consecuencia de mutaciones que tienen lugar durante el desarrollo y puede afectar a la estirpe germinal o a las células somáticas. El término herencia mendeliana se refiere a patrones de herencia que son dominantes o recesivos, ligados a X o a los autosomas, por lo que no importa qué alelo procede del padre o de la madre. Aproximadamente 100 genes codificados en los cromosomas del núcleo muestran herencia no mendeliana por impronta (imprinting). Esta inactiva la expresión de pequeñas regiones de los cromosomas mediante la metilación de determinados dinucleótidos CpG. Los genes maternos con impronta no se pueden expresar en la descendencia de la madre, aunque esa descendencia puede transmitir estos genes a la siguiente generación. Esto mismo se aplica a los genes paternos con impronta. La impronta ya existente se elimina después de la fecundación en las células que dan lugar a las células germinales primordiales y se restablece posteriormente, de manera que todos los ovocitos, así como todos los

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espermatozoides, presenten impronta en determinados conjuntos de genes. Por ejemplo, la hija de los progenitores no puede expresar los genes maternos con impronta; por lo tanto, expresará solo los alelos paternos homólogos. Lo inverso se aplica a los genes paternos con impronta. Los ovocitos de esta hija presentarán impronta en un conjunto predeterminado de genes; la mitad de los alelos de estos genes se originan en su madre y la mitad en su padre.

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3. Mutaciones y marcadores Las mutaciones a menudo se clasifican por su efecto sobre la transcripción y la traducción. Los marcadores son secuencias conocidas en localizaciones conocidas del genoma. Son útiles para relacionar una enfermedad con una localización en el ADN. El término estirpe germinal se refiere a las células de las gónadas que dan lugar a los ovocitos y los espermatozoides. Todas las demás células se llaman células somáticas. Las mutaciones en la estirpe germinal son hereditarias, y las mutaciones somáticas no. La mayor parte de las neoplasias se producen en células somáticas. Una mutación se denomina mutación de novo si se ve en la descendencia, pero no en la sangre periférica ni en los tejidos normales de los progenitores. Es muy probable que la mutación se haya producido en la estirpe germinal de un progenitor y, por ello, es hereditaria. También es posible que solo una parte de la estirpe germinal de un progenitor sea portadora de la mutación de novo. Las mutaciones de las células somáticas son frecuentes y pueden dar lugar a neoplasias; a estas mutaciones se las llama simplemente mutaciones, no mutaciones de novo. Las mutaciones a menudo se subclasifican en los tipos siguientes: ■ Una mutación en la región codificante se produce en una región del gen que se transcribe y forma parte del ARNm que se traduce en una proteína. ■ Una mutación por desplazamiento del marco de lectura desplaza el marco de lectura de los codones. ■ Una mutación de sentido equivocado convierte el codón de un aminoácido en el codón de un aminoácido diferente. ■ Una mutación sin sentido convierte el codón de un aminoácido en un codón finalizador. ■ Una mutación del promotor puede alterar la unión de los factores de transcripción y, de esta manera, modificar la cantidad de ARNm que se sintetiza. ■ Una sustitución silente (sustitución sinónima) no modifica la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada porque el código genético está degenerado (v. cap. 7). ■ Una mutación del punto de empalme puede afectar a la eficiencia del empalme y, por tanto, alterar la cantidad de ARNm con empalme normal que se produce. Además, el ARNm con empalme normal habitualmente se elimina mediante degradación mediada por mutación finalizadora. ■ Una mutación del procesado del extremo 3′ puede afectar a la eficiencia del procesado del extremo 3′ del ARNm y de esta manera alterar la cantidad de ARNm que se produce.

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Las repeticiones de trinucleótidos son repeticiones de la misma secuencia de tres nucleótidos (p. ej., CAG). Algunas repeticiones de trinucleótidos son inestables, se expanden y producen enfermedades cuando son demasiado largas. Un polimorfismo habitualmente se refiere a una variación de la secuencia que es poco frecuente, pero que pese a todo se produce con cierta frecuencia (p. ej., en más del ∼1% de todas las personas). Un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) es un polimorfismo que afecta a un solo nucleótido. Los marcadores polimorfos son secuencias de ADN en localizaciones conocidas que muestran cierta variación de la secuencia en la población. Son importantes porque permiten que un genetista determine si una persona ha heredado una secuencia particular de la madre o del padre y si la secuencia se asocia a un trastorno. Análisis de ligamiento se refiere a establecer una relación entre una región del ADN y un fenotipo. El análisis de ligamiento se basa en el conocimiento de las secuencias de marcadores en todo el genoma humano, y también en el hecho de que dos secuencias de ADN que están cerca una de otra en un cromosoma tienen mayor probabilidad de heredarse juntas que dos secuencias de ADN que están separadas en un cromosoma, o incluso en cromosomas diferentes. El entrecruzamiento durante la meiosis es el motivo por el que dos secuencias de ADN que están alejadas en un cromosoma no se heredan juntas necesariamente. Muchas enfermedades muestran heterogeneidad genética porque un determinado fenotipo puede deberse a una mutación en uno de varios genes diferentes. A menudo estos genes participan en la misma vía metabólica o de transducción de señales.

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Resumen ■ 46,XX y 46,XY son los cariotipos humanos normales. La aneuploidía es una dotación de cromosomas anómala. Aparece, por ejemplo, en el síndrome de Turner (45,X), el síndrome de Klinefelter (47,XXY) y el síndrome de Down (47,XY, + 21). ■ Una persona heterocigota compuesta habitualmente tiene dos alelos causantes de enfermedad diferentes. ■ Penetrancia se refiere a la frecuencia con la que un genotipo patógeno produce un fenotipo determinado. Expresividad variable se refiere a la variabilidad interindividual en el fenotipo del mismo genotipo patógeno. ■ Haploinsuficiencia indica que una única copia normal de un gen es insuficiente para mantener un fenotipo normal. Una mutación con ganancia de función da lugar a una nueva actividad o un aumento de la actividad de una proteína. Un efecto dominante negativo a menudo está causado por una molécula mutante que forma dímeros y multímeros con moléculas normales, lo que altera mucho la función del complejo resultante. ■ La impronta materna y paterna de un pequeño conjunto de genes, que tiene lugar en los ovocitos y espermatozoides en desarrollo, da lugar a la herencia no mendeliana. ■ El análisis de ligamiento utiliza marcadores polimorfos para determinar la relación entre ADN y enfermedad.

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CAPÍTULO 6

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Transcripción y procesado del ARN Sinopsis ■ La transcripción es el proceso de sintetizar un ARN a partir de una plantilla de ADN. ■ El ADN puede estar empaquetado formando nucleosomas y se puede compactar aún más para constituir la heterocromatina, de modo que es inaccesible a la maquinaria de la transcripción. ■ En sentido 5′ de un gen hay una región promotora que contiene sitios de unión para unas proteínas reguladoras que se unen al ADN, llamadas factores de transcripción. La disponibilidad de estos factores de transcripción depende del desarrollo, el tipo celular y varias señales del entorno. ■ La transcripción también requiere factores de transcripción generales y ARN polimerasa. ■ Durante la transcripción, un complejo de proteínas reconoce el extremo 5′ del ARN y añade un casquete de metilguanosina, mientras que otro complejo reconoce un sitio de poliadenilación más allá en sentido 3′ en la cadena de ARN en crecimiento, escinde el ARN y añade una cola de poli(A). ■ Los espliceosomas eliminan grandes segmentos (intrones) del preARNm y conectan las secuencias restantes (exones). ■ Los sitios de inicio de la transcripción alternativos, los sitios de poliadenilación alternativos, el corte y empalme (splicing) alternativo, los sitios de inicio de la traducción alternativos y las modificaciones postraduccionales alternativas de las proteínas contribuyen a una diversidad de las proteínas que supera con mucho la diversidad de los genes.

Objetivos de aprendizaje Para dominar este tema, debería ser capaz de hacer lo siguiente: ■ Describir el efecto de la estructura de la cromatina sobre la transcripción, teniendo en cuenta la metilación del ADN y de las histonas, y la acetilación de las histonas. ■ Explicar el significado de los términos dinucleótido CpG e isla CpG. ■ Describir la base de la herencia epigenética.

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■ Describir las relaciones de las cadenas codificantes, las cadenas no codificantes y las cadenas plantilla entre sí y con el cromosoma entero. ■ Comparar y contrastar los elementos promotores, potenciadores, activadores, represores y silenciadores. ■ Resumir la formación de un complejo de inicio de la transcripción, prestando especial atención a los pasos que pueden ser regulados por metabolitos u hormonas (particularmente esteroides). ■ Interpretar un gráfico de la estructura de un promotor y de un gen. ■ Describir las modificaciones del precursor de ARNm (pre-ARNm) en los extremos 5′ y 3′ y explicar la finalidad de estas modificaciones. ■ Describir el corte y empalme (splicing) del pre-ARNm y presentar un ejemplo de splicing alternativo. ■ Comparar y contrastar los exones y los intrones y relacionarlos con un gen, así como con el producto final de la traducción. ■ Explicar de qué manera una mutación puntual puede alterar el corte y empalme y, en consecuencia, la secuencia de aminoácidos de una proteína. ■ Explicar el término punto de corte y empalme críptico y presentar un ejemplo.

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1. La metilación y el empaquetamiento del ADN impiden la transcripción La metilación del ADN y las histonas generalmente hace que el ADN metilado se empaquete formando heterocromatina, que no se transcribe. El patrón de metilación del ADN se puede transmitir de una célula a otra en un proceso llamado herencia epigenética. Se trata de una parte normal del desarrollo y la diferenciación celular. La metilación es anormal en muchas neoplasias, y también en la mayor parte de los casos de síndrome de Rett, que se asocia a alteraciones en el desarrollo del sistema nervioso. La acetilación generalmente tiene el efecto opuesto a la metilación, porque hace que la cromatina esté disponible para la transcripción. El término transcripción se refiere a la síntesis de ARN a partir de una plantilla de ADN. La transcripción está controlada a varios niveles: la compactación del ADN en heterocromatina no transcribible, la formación de nucleosomas, la metilación de las regiones promotoras, y la disponibilidad y la actividad de factores que forman parte de la maquinaria de transcripción. En las células, el ADN, junto con las histonas y otras proteínas, forma la cromatina. La microscopia óptica y electrónica revela dos formas de cromatina: eucromatina y heterocromatina (fig. 6.1). Las células habitualmente tienen más eucromatina que heterocromatina. La heterocromatina está algo concentrada cerca de la periferia del núcleo y está empaquetada más densamente que la cromatina. Se desconoce la estructura física de la heterocromatina, aunque probablemente incluya el empaquetado de los nucleosomas en una fibra de cromatina de 30 nm que después se pliega en una forma aún más compacta (v. fig. 1.6 y sección 4 del cap. 1).

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FIG. 6.1

Eucromatina y heterocromatina en el núcleo de un linfocito, imagen de microscopia electrónica de transmisión. El núcleo llena casi todo el linfocito.

El núcleo está rodeado por una membrana interna y una externa que contienen poros nucleares. Las dos membranas representan una capa de retículo endoplasmático (RE) que rodea el núcleo. Las membranas son estabilizadas por la lámina nuclear, que contiene laminas, un tipo de proteína que forma los denominados filamentos intermedios. Otras proteínas unen la heterocromatina a la lámina nuclear. Los genes de la eucromatina se pueden transcribir, pero los de la heterocromatina no. En la heterocromatina los nucleosomas están compactados en estructuras de orden superior que impiden el acceso de las proteínas que son necesarias para la transcripción. El ADN de la eucromatina también está empaquetado en nucleosomas, pero hay diversos mecanismos para modificar y desplazar los nucleosomas a fin de permitir la transcripción. La heterocromatina se forma de una manera específica de cada tejido. Durante el desarrollo y la diferenciación tal vez un tercio del genoma pasa de la eucromatina a la heterocromatina o viceversa. Otras partes del genoma, como los telómeros y centrómeros, el brazo largo del cromosoma Y y grandes segmentos de los cromosomas 1, 9 y 16, siempre están condensadas formando heterocromatina. Como el ADN de estas regiones no se transcribe, incluso grandes inserciones y deleciones en el ADN no tienen efectos sobre el fenotipo de una persona. De hecho, los informes citogenéticos a menudo mencionan que el tamaño anormalmente grande de una de estas regiones

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heterocromáticas es un polimorfismo normal. La metilación de las bases de citosina por una ADN metiltransferasa favorece la incorporación del ADN a la heterocromatina. La metilación del ADN se produce principalmente en la C de una secuencia 5′-CG-3′ (a menudo llamada dinucleótido CpG, donde p se refiere al fosfato que forma un enlace fosfodiéster; v. fig. 1.2). Por cada 5′-CG en una cadena de ADN existe un 5′CG en la cadena de ADN complementaria (fig. 6.2). Las C de las dos cadenas suelen estar metiladas.

FIG. 6.2

Mantenimiento de la metilación de CpG, una modificación epigenética. La metilación se produce cuando ya está metilado un CpG en la cadena complementaria. Me, grupo metilo.

Las islas CpG son segmentos de ADN que contienen una fracción relativamente elevada de dinucleótidos CG. La metilcitosina es mutágena porque la desaminación espontánea ocasional da lugar a timina. Por ello, el genoma contiene menos dinucleótidos CG de lo que cabría esperar tomando como base la estadística. Por el contrario, las islas CpG contienen casi la fracción esperada de dinucleótidos CG. Aunque en el genoma en general el ∼70% de los dinucleótidos CG están metilados, los CG de las islas CpG están en su mayor parte no metilados. Una isla CpG típica mide ∼1.000 pb de longitud. El patrón de metilación de CG difiere según el tipo celular y también puede cambiar a lo largo del tiempo. La metilación de la C del ADN se transmite durante la división celular, y

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de esta manera da lugar a herencia epigenética (v. fig. 6.2). Por lo tanto, una célula hereda no solo el ADN de la célula progenitora (herencia genética), sino también el patrón de empaquetado de la cromatina de la célula progenitora (herencia epigenética). Los fenómenos epigenéticos son importantes, por ejemplo, en la impronta genómica (imprinting), el desarrollo, la diferenciación celular y la inactivación del cromosoma X en las mujeres (v. cap. 5). Durante la replicación del ADN, una ADN metiltransferasa metila la C de un dinucleótido CpG, pero solo si la C de la cadena complementaria ya está metilada. De esta manera, las secuencias metiladas siguen estando metiladas, y las secuencias no metiladas siguen estando no metiladas. Las ADN metiltransferasas utilizan S-adenosilmetionina (SAM; v. fig. 36.6 y sección 4 del cap. 36) como donante de grupos metilo. La formación de células sanguíneas (v. fig. 16.3 y sección 1.2 del cap. 16) constituye un ejemplo de herencia epigenética. Las células progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea dan lugar a los eritrocitos y a diversos tipos de leucocitos. Cada uno de estos tipos celulares en desarrollo posee un patrón diferente de condensación de la cromatina. Los eritroblastos (precursores de los eritrocitos) empaquetan los genes de las inmunoglobulinas en la heterocromatina, mientras que los leucocitos empaquetan los genes de la hemoglobina en la heterocromatina. La carencia de la proteína de unión a CpG 2 (MECP2) causa síndrome de Rett, un trastorno neurológico progresivo que es la causa más frecuente de coeficiente intelectual bajo en mujeres. MECP2 se expresa ampliamente, aunque es especialmente abundante en las neuronas maduras. No se conoce con exactitud la función de MECP2. Se une a C y nucleosomas metilados, compite con una histona, curva el ADN y reprime o activa la transcripción. El síndrome de Rett se hereda con un patrón dominante ligado a X y tiene una prevalencia de ∼1 de cada 12.000 nacimientos. En los hombres la enfermedad suele ser letal durante la vida intrauterina. Las mujeres que tienen síndrome de Rett comienzan a presentar regresión a los 1-4 años de edad. En muchas neoplasias las islas CpG están metiladas, lo que lleva a la supresión de la transcripción de los genes asociados, habitualmente supresores tumorales (v. cap. 8). La compactación del ADN para formar heterocromatina está dirigida principalmente por el estado de algunas de las modificaciones de las histonas que se enumeran en la tabla 1.1. El empaquetado del ADN y las histonas en nucleosomas se describe en la figura 1.6 y en la sección 4 del capítulo 1. Las modificaciones de las histonas (p. ej., metilación y acetilación) se producen en las colas de las histonas, que sobresalen de los nucleosomas. La compactación de los nucleosomas en fibras de 30 nm y la compactación adicional hasta formar heterocromatina comienzan principalmente en los puntos de secuencias repetitivas o muy metiladas del ADN, y se extienden y se detienen por la presencia de determinados elementos del ADN y de ARN. El ADN metilado puede atraer histona metiltransferasas que metilan las histonas, y las histonas metiladas pueden atraer proteínas que contienen un

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cromodominio (dominio modificador de la organización de la cromatina) y favorecen la formación de heterocromatina. Las histona metiltransferasas (igual que las ADN metiltransferasas) utilizan SAM (v. fig. 36.6 y sección 4 del cap. 36) como donante de grupos metilo. Las histona metiltransferasas pueden metilar a la histona H3 en el residuo de lisina 9 (abreviado H3K9). Las proteínas que contienen un cromodominio se pueden unir a la histona metilada H3 (H3K9me). Por el contrario, el aumento de la metilación de la lisina 4 de la misma histona H3 (H3K4me) favorece la formación de eucromatina. Las lisina acetiltransferasas del núcleo y el citosol pueden utilizar acetilcoenzima A (acetil-CoA) para añadir un grupo acetilo al grupo amino de la cadena lateral de un residuo de lisina. La acetil-CoA para esta reacción procede del citrato que ha salido de las mitocondrias al citosol como se describe en la fig. 27.2 y en la sección 2 del capítulo 27. La acetilación de las cadenas laterales de lisina de las histonas relaja la estructura de la cromatina. La acetilación de la lisina es leída por proteínas que contienen un dominio lector de acetil lisina, como un bromodominio. Las histona desacetilasas (HDAC) pueden eliminar un grupo acetilo de una cadena lateral de lisina de una histona. La desacetilación de las histonas favorece la formación de heterocromatina. Los seres humanos producen 18 HDAC diferentes. Entre los fármacos inhibidores de las HDAC que se utilizan actualmente se incluyen los siguientes: ■ El vorinostat y la romidepsina se utilizan para el tratamiento del linfoma de linfocitos T cutáneo, un trastorno en el que de los linfocitos T malignos forman tumores en la piel. ■ El belinostat y la romidepsina se utilizan para el tratamiento del linfoma de linfocitos T periférico, una enfermedad en la que se encuentran linfocitos T malignos en diversos tejidos, como ganglios linfáticos, hígado y médula ósea. ■ El panobinostat se utiliza con bortezomib (un inhibidor de los proteosomas) y dexametasona (glucocorticoide) para el tratamiento del mieloma múltiple, una forma de linfoma causada por linfocitos B anómalos. ■ El ácido valproico se utiliza en pacientes que tienen convulsiones; algunos de sus efectos se pueden deber a la inhibición de las HDAC. La conjugación del residuo de lisina 120 de la histona H2B con una única proteína de 76 aminoácidos denominada ubicuitina por un complejo de ubicuitina ligasa favorece la transición de heterocromatina eucromatina. La ubicuitina es una proteína pequeña y, por lo tanto, es mucho mayor que un grupo metilo o acetilo. Las desubicuitinasas eliminan la ubicuitina de las histonas y así facilitan la incorporación de los nucleosomas a la heterocromatina.

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2. El proceso de la transcripción Durante la transcripción se utiliza una cadena de ADN como plantilla para sintetizar un ARN. La secuencia del ARN es complementaria a la cadena plantilla de ADN e idéntica a la cadena codificadora, excepto que el ARN contiene uracilo en lugar de timina. En sentido 5′ de un gen hay una región promotora que contiene múltiples elementos a los que se unen los factores de transcripción. La formación de estos complejos proteína-ADN es esencial para una transcripción específica y regulada de genes individuales. La actividad de algunos factores de transcripción depende de la unión de ligandos, como las hormonas esteroideas. Mediante el uso de diferentes elementos promotores y puntos de inicio de la transcripción, un único gen puede dar lugar a varias proteínas diferentes. Varios fármacos de uso clínico afectan a la actividad de los factores de transcripción. Durante la transcripción el ARN se sintetiza en dirección 5′→3′ utilizando como modelo la secuencia de la cadena plantilla de ADN (la cadena plantilla de ADN se lee en dirección 3′→5′). La síntesis de ARN en dirección 5′→3′ es similar a la síntesis de ADN en dirección 5′→3′ durante la replicación (v. fig. 3.4), excepto que el ARN contiene ribonucleótidos (no desoxirribonucleótidos) y uracilo en lugar de timina. La cadena codificante (o cadena con sentido) tiene la misma direccionalidad y secuencia (excepto T en lugar de U) que el ARN que se sintetiza a partir de la cadena plantilla. La secuencia de la cadena codificante y la del ARN son complementarias a la secuencia de la cadena plantilla. En ocasiones la cadena plantilla se denomina cadena no codificante o cadena antisentido. Un gen se suele definir como un segmento de ADN que se transcribe a ARN. Por convención, la dirección de un cromosoma va del extremo del brazo corto al extremo del brazo largo, y la dirección del gen es la dirección de la cadena codificante (5′→3′; fig. 6.3). Un gen que tiene la misma dirección que el cromosoma está en orientación directa; si la dirección es la contraria, el gen está en orientación inversa. Cada cromosoma contiene muchos genes en orientación directa y muchos en orientación inversa.

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FIG. 6.3

Los genes de un cromosoma pueden estar orientados en dos sentidos. Por convención, la orientación se refiere a la cadena codificante. La orientación directa va del extremo del brazo corto del cromosoma al extremo del brazo largo del cromosoma. El ARN se alarga en el grupo hidroxilo en posición 3′. La dirección de la transcripción es la misma que la dirección de la flecha verde del transcrito.

Los genes del ADN mitocondrial (v. fig. 23.7) están distribuidos por igual entre las dos cadenas de ADN (denominadas cadena pesada y cadena ligera). La transcripción a menudo se divide en inicio, elongación y terminación. El inicio se refiere al ensamblaje muy regulado de un complejo de factores de transcripción y coactivadores al que después se une la ARN polimerasa. La elongación es la síntesis de un ARN por la ARN polimerasa. La terminación es el proceso que detiene la ARN polimerasa y la retira del ADN. En dirección 5′ de un gen hay una región promotora formada por muchos elementos promotores (elementos reguladores de acción cis, fig. 6.4) que afectan a la velocidad de la transcripción, como se analiza con más detalle en este capítulo.

FIG. 6.4 Promotor en sentido 5′ de un gen. Por convención, el primer nucleótido que se transcribe es +1, y el nucleótido 5′ con respecto a él es −1. Todos los elementos promotores están formados por

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nucleótidos portadores de números negativos.

Todos los factores de transcripción tienen un dominio de unión al ADN y se unen a los elementos promotores, potenciadores o silenciadores (v. más adelante) sobre el ADN. Los elementos promotores a menudo tienen ∼5-15 nucleótidos de longitud. Se debe tener en cuenta que el término factor de transcripción excluye los factores de transcripción generales (GTF) que se describen más adelante. Los factores de transcripción pueden ser activadores o represores de la transcripción; la unión de los factores de transcripción a los elementos reguladores del ADN determina la frecuencia con la que se transcribe un gen. Las figuras 6.5 y 6.6 muestran ejemplos de una parte de un factor de transcripción unido a un segmento de ADN.

FIG. 6.5

Estructura del factor de transcripción del receptor X hepáticoreceptor de retinoides X unido al ADN.

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El factor de transcripción se une a dos secuencias AGGTCA que están separadas entre sí cuatro nucleótidos. Los dominios de unión al ligando se unen a oxiesteroles (p. ej., 27-hidroxicolesterol) y ácido retinoico, respectivamente (v. sección 4.1 en cap. 29). (Basado en el archivo de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 4NQA de Lou X, Toresson G, Benod C, et al. Structure of the retinoid X receptor α-liver X receptor β [RXRα-LXRβ] heterodimer on DNA. Nat Struct Mol Biol. 2014;21:277-281.)

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FIG. 6.6 La proteína de unión a elementos reguladores de esteroles 1a (SREBP-1a) como ejemplo de factor de transcripción que utiliza una cremallera de leucina para dimerizarse. Los átomos de la leucina se muestran como esferas (O, rojas; N, azules; C, grises). (Basado en el archivo de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 1AM9 de Párraga A, Bellsolell L, Ferré-D’Amaré AR, Burley SK. Co-crystal structure of sterol regulatory element binding protein 1a at 2.3 A resolution. Structure. 1998;6:661-672.)

Los factores de transcripción se unen a la periferia de una doble hélice de ADN, es decir, a los surcos de la hélice (v. figs. 6.5 y 6.6); esto la mayor parte de las veces afecta tanto a la cadena codificante como a la cadena plantilla. El sitio de unión de un factor de transcripción habitualmente solo se describe como la secuencia 5′→3′ porque se puede inferir fácilmente la secuencia complementaria. Muchos factores de transcripción se unen al ADN en forma de homodímeros o heterodímeros y, por lo tanto, contienen un dominio de dimerización. Una cremallera de leucina (v. fig. 6.6) es un motivo habitual en algunos de estos factores de transcripción. La aposición de cadenas laterales de leucina crea un efecto hidrófobo que mantiene juntos los monómeros de manera reversible. Algunos factores de transcripción contienen un dominio de unión al ligando (v. fig. 6.5). Entre estos factores de transcripción está la familia de los receptores de hormonas nucleares, que contiene 48 miembros e incluye receptores para esteroides, vitamina D, ácido retinoico y hormona tiroidea, entre otros muchos. Los receptores de hormonas esteroideas incluyen los receptores para glucocorticoides, mineralocorticoides, estrógenos, progesterona y dihidrotestosterona. Los esteroides pueden atravesar las membranas, y los receptores de esteroides que afectan a la transcripción están en el citosol o en el núcleo. La descripción de los receptores de glucocorticoides sirve como ejemplo de la complejidad de la función del receptor de hormonas esteroideas. Cuando no hay glucocorticoides, los receptores de glucocorticoides están en su mayor parte en el citosol, donde están unidos a un complejo de chaperonas que incluye la proteína del choque térmico 90 (HSP90; v. también sección 4.1 en cap. 7). Cuando el cortisol (el principal glucocorticoide) se une al receptor de glucocorticoides, el receptor se disocia de HSP90 y se dirige al núcleo gracias a su secuencia de localización nuclear. En el núcleo, el receptor activado se puede unir a un elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE). Una secuencia del GRE típica es nGnACAnnnnGTnC (n = nucleótido variable). El GRE puede estar cerca del promotor o alejado de él (hasta >100.000 nucleótidos). El receptor de glucocorticoides se puede unir directamente al ADN y atraer coactivadores y correpresores; también se puede fijar al ADN por su unión a otros factores de transcripción. También hay GRE negativos (nGRE); cuando un GR se une a un nGRE, se reprime la transcripción. Los nGRE tienen una secuencia de consenso diferente a los

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GRE. La acción de los glucocorticoides es compleja y puede variar de unos tejidos a otros como consecuencia de las isoformas de los receptores y los efectos epigenéticos. Solo existe un gen para el receptor de glucocorticoides. El corte y empalme alternativo del ARN (v. sección 3.4 y fig. 6.14) da lugar a varias isoformas. GRα es habitualmente el receptor de glucocorticoides predominante que responde a los glucocorticoides. GRβ es una isoforma que no activa la transcripción y, por ello, puede antagonizar a GRα. De hecho, el aumento de la expresión de GRβ que se observa en el asma y la artritis reumatoide, por ejemplo, se acompaña de una menor respuesta a los glucocorticoides. Otras isoformas de GR también pueden antagonizar a GRα. Las variaciones en el uso del sitio de inicio de la traducción y en la modificación postraduccional (p. ej., fosforilación y acetilación) pueden dar lugar a otras isoformas (v. también cap. 7). Aunque los GRE son un prerrequisito para la unión de los GR, se ven muchas variaciones de unas células a otras en los GRE que están disponibles para unirse a los GR debido a una estructura de cromatina específica de célula. La transcripción depende de la formación de un complejo de preinicio por activadores de la transcripción, coactivadores de la transcripción, GTF y ARN polimerasa en la región promotora de un gen (fig. 6.7).

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FIG. 6.7

Modelo de factores de transcripción generales (GTF) que forman parte de un complejo de preinicio. El complejo contiene GTF y ARN polimerasa II. No se muestran los factores de transcripción ni los coactivadores. (Datos de Murakami K, Tsai KL, Kalisman N, Bushnell DA, Asturias FJ, Kornberg RD. Structure of an RNA polymerase II preinitiation complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112:13543-13548.)

Para la transcripción, los factores de transcripción se unen a elementos promotores (elementos de respuesta al ADN). Habitualmente un promotor contiene muchos elementos promotores diferentes (v. fig. 6.4). Algunos factores de transcripción contienen un dominio de transactivación mediante el cual se pueden unir a correguladores de la transcripción. Los correguladores de la transcripción pueden ser coactivadores de la transcripción o correpresores de la transcripción. Los correguladores de la transcripción se unen a los factores de transcripción, pero no al ADN. Algunos coactivadores de la transcripción facilitan la formación del complejo de preinicio; otros favorecen la unión de enzimas que modifican las histonas y así hacen que el ADN esté disponible para su transcripción, y otros coactivadores eliminan del ADN proteínas que dificultarían la transcripción.

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La transcripción de algunos genes aumenta mucho cuando los factores de transcripción se unen a secuencias potenciadoras del ADN. Los potenciadores pueden formar parte del promotor, pueden estar a miles de nucleótidos en sentido 5′ o 3′ respecto al promotor e incluso se pueden encontrar dentro de los genes. Los potenciadores incrementan la transcripción solo cuando hay activadores de la transcripción unidos a los elementos promotores. Los potenciadores tienen la misma actividad en las dos orientaciones en relación con el sitio de inicio de la transcripción. Para que un factor de transcripción unido a potenciadores incremente la formación de un complejo de preinicio, el ADN que contiene el potenciador se puede incurvar hacia atrás. La cromatina está organizada de tal manera que algunos potenciadores están físicamente cerca de las regiones promotoras sobre las que actúan; esto incrementa la especificidad de la potenciación de la transcripción. Los represores (proteínas) se unen a elementos silenciadores del ADN y así reducen la velocidad de la transcripción. Igual que los potenciadores, los silenciadores pueden estar en la región promotora, en el gen o a miles de nucleótidos de la región promotora, y tienen la misma actividad en las dos orientaciones en relación con el sitio de inicio de la transcripción. Los factores de transcripción unidos a los elementos promotores atraen GTF (proteínas TFII), que se unen al promotor nuclear. Al contrario de otros factores de transcripción, los GTF se utilizan para la transcripción de la mayor parte de los genes. El promotor nuclear forma parte de la región promotora y está cerca del sitio de inicio de la transcripción. Algunos promotores nucleares contienen una secuencia o caja TATA (TATA box) (secuencia consenso TATAAA) aproximadamente en el nucleótido −30; otros contienen un motivo de inicio en el sitio de inicio de la transcripción y un elemento promotor en sentido 3′ (DPE) aproximadamente en el nucleótido +30 (es decir, en sentido 3′ respecto al sitio de inicio de la transcripción). Los factores de transcripción unidos al ADN favorecen la unión del GTF TFIID al promotor nuclear. El complejo de TFIID tiene una composición variable y contiene una proteína de unión a TATA (TBP), que se une a la caja TATA. Posteriormente los GTF TFIIA, TFIIB, TFIIC, TFIIE, TFIIF, TFIIG Y TFIIH se unen a TFIID, formándose el complejo de preinicio. TFIIB se une al elemento de reconocimiento B (BRE) del promotor nuclear aproximadamente en el nucleótido –35 (inmediatamente en sentido 5′ respecto a la caja TATA, en caso de que exista). Una vez que se ha ensamblado el complejo de inicio, la helicasa de un GTF (v. fig. 6.7) desenrolla la hélice de ADN para que una única cadena pueda entrar en el sitio activo de la ARN polimerasa. Entonces la ARN polimerasa puede empezar a transcribir el gen. El sitio de inicio de la transcripción está determinado por la localización de los elementos promotores, incluyendo la caja TATA (si está presente), la conformación local del ADN (como consecuencia de la composición de nucleótidos), la posición de los nucleosomas cerca del punto de inicio y la

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composición de histonas de los nucleosomas (tabla 6.1). Los sitios de inicio de la transcripción de algunos genes están limitados a un único nucleótido, mientras que los de otros se pueden extender a lo largo de 30 a 100 nucleótidos. Algunos genes contienen un sitio de inicio de la transcripción que está en un nucleosoma particularmente lábil (por una composición de histonas especial) o cerca de él.

Tabla 6.1 Características de los sitios de inicio de la transcripción

Cuando se utilizan puntos de inicio de la transcripción alternativos se pueden sintetizar múltiples transcritos de ARN diferentes y múltiples proteínas a partir de un único gen. Las células eucariotas contienen tres ARN polimerasas. En la mayoría de las circunstancias, las actividades de las ARN polimerasas I y III son responsables de la mayor parte de la actividad de transcripción de una célula. Tenemos el mayor conocimiento de la transcripción realizada por la ARN polimerasa II. Los transcritos de la ARN polimerasa II incluyen el ARN mensajero (ARNm), algunos de los ARN nucleares pequeños (ARNnp, small nuclear RNAs o snRNAs) que se utilizan para el corte y empalme (v. sección 3.3) y los micro-ARN (miARN), que pueden alterar la estabilidad del ARNm y la traducción (v. sección 3 en cap. 7). La ARN polimerasa utiliza la cadena de ADN plantilla para sintetizar un ARN complementario insertando U en los lugares en los que la ADN polimerasa insertaría T. El propio ARN se sintetiza en dirección 5′→3′ (igual que la síntesis del ADN). En consecuencia, la cadena plantilla de ADN se lee en dirección 3′→5′ (igual que la cadena plantilla de ADN durante la replicación del ADN). La ARN polimerasa II transcribe ∼60 nucleótidos por segundo. El extremo 3′ del ARNm no se forma por la finalización de la transcripción, sino por la escisión del ARN en sentido 3′ de una señal de poliadenilación. La ARN polimerasa II después finaliza la transcripción en cualquier lugar desde unos pocos hasta varios miles de pares de bases en sentido 3′ desde el punto de escisión, mediante mecanismos que se siguen investigando. Mientras esté presente el complejo de preinicio, la ARN polimerasa puede comenzar una nueva tanda de transcripción. En conjunto, los complejos de los GTF y las ARN polimerasas I y III

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transcriben los genes que codifican los ARN ribosómicos (ARNr; v. sección 3 en cap. 7), los ARN de transferencia (ARNt; v. sección 2 en cap. 7) y algunos de los ARNnp que forman parte del espliceosoma (v. sección 3.3). La abundancia de estos ARN influye en el crecimiento y la replicación celulares. Las mitocondrias contienen un sistema de transcripción más sencillo que el núcleo. En su forma más sencilla, el sistema mitocondrial requiere factor de transcripción mitocondrial A, factor de transcripción mitocondrial B2 y ARN polimerasa mitocondrial. El ADN mitocondrial codifica solo dos ARNr, 22 ARNt y 13 proteínas que participan en la fosforilación oxidativa (v. fig. 23.3 y sección 3 del cap. 23). Por lo tanto, toda la maquinaria de transcripción está codificada en el núcleo, se sintetiza en el citosol y después pasa al interior de las mitocondrias. El ADN mitocondrial contiene tres promotores y genera varios transcritos que dan lugar a múltiples ARN. Algunos fármacos de uso clínico y suplementos de venta sin receta influyen en la transcripción. Los glucocorticoides se utilizan mucho como inmunodepresores (v. sección 3 en cap. 31). En las mujeres, diversos estrógenos y progestágenos se utilizan como anticonceptivos, para tratar la esterilidad y reducir los síntomas de la menopausia (v. sección 2.4 en cap. 31). Los fibratos se utilizan para reducir la hipertrigliceridemia mediante la activación de los factores de transcripción del receptor activado por proliferadores de peroxisomas α (PPAR-α) (v. sección 4 en cap. 27 y sección 8.1 en cap. 28). Las tiazolidindionas a veces se utilizan para reducir la glucemia mediante la activación de los factores de transcripción de PPAR-γ (v. sección 5.3 en cap. 39). El ácido todo-trans retinoico se utiliza para tratar el acné y actúa, al menos en parte, induciendo la activación de los receptores de ácido retinoico y los receptores de retinoides X (RXR; v. sección 7 en cap. 28, sección 4.1 en cap. 29 y sección 5 en cap. 31). La vitamina D, que actúa a través de factores de transcripción heterodiméricos formados por un receptor de vitamina D y un RXR, regula la homeostasia del calcio y el fosfato (v. fig. 31.22 y sección 5 en cap. 31).

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3. Procesado del ARN durante y después de la transcripción Durante la transcripción, el extremo 5′ de la cadena de ARN en crecimiento se recubre con metilguanosina trifosfato. En respuesta a una señal de poliadenilación se corta el extremo 3′ de la cadena de ARN en crecimiento y se añade una cola de poli(A). Los sitios de poliadenilación alternativos pueden influir en la estabilidad del ARNm e incluso en la secuencia de la proteína. El ARN contiene segmentos largos (intrones), que se eliminan, y segmentos cortos (exones), que se mantienen y se cortan y empalman juntos durante la transcripción y después. La mayor parte de los ARN se pueden cortar y empalmar de múltiples formas alternativas incluyendo o excluyendo exones completos o partes de exones, lo que da lugar a diversas proteínas. El ARNm maduro sale del núcleo al citosol.

3.1. Recubrimiento con un casquete del preARNm Durante la transcripción, el extremo 5′ de la cadena de ARN en crecimiento se recubre con un casquete de 7-metilguanosina trifosfato (fig. 6.8). La metilguanosina se añade en orientación «inversa» porque se une al ARN en dirección 3′ a 5′ (no la dirección habitual 5′ a 3′). Además, hay un grupo trifosfato entre la 7-metilguanosina y el extremo 5′ del ARN. La estructura del casquete a menudo se abrevia m7GpppN (por analogía, el resto del ARN se describiría como pNpNpN…).

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FIG. 6.8

Recubrimiento del ARN con un casquete de guanosina trifosfato metilado.

Para la formación del casquete, primero se elimina un grupo fosfato del grupo trifosfato del extremo 5′ del ARN recién sintetizado, después se une guanosina monofosfato, y después se metila la base guanina en la posición N7. Las enzimas que catalizan la formación del casquete se unen transitoriamente a la ARN polimerasa. El casquete está completo cuando la ARN polimerasa ha producido un transcrito de ∼30 nucleótidos. El casquete es esencial para la salida del ARNm del núcleo (v. sección 3.5) y la traducción (v. sección 3 en cap. 7).

3.2. Poliadenilación del pre-ARNm La mayor parte de los ARNm precursores (pre-ARNm) están poliadenilados, es decir, el extremo 3′ se prolonga con una cola de poli(A) de ∼50-100 nucleótidos. Durante la transcripción, un gran complejo de proteínas reconoce la secuencia AAUAAA (o una secuencia similar) del pre-ARNm como señal de poliadenilación, y después corta el pre-ARNm entre la señal de poliadenilación y un elemento de secuencia en sentido 3′ (DSE, downstream sequence element) rico en U o GU. Una poli(A) polimerasa después genera la cola de poli(A) sin utilizar una plantilla de ADN (fig. 6.9). El sitio real de la poliadenilación está ∼10-35 nucleótidos en sentido 3′ respecto a la señal de poliadenilación.

FIG. 6.9 Poliadenilación del ARN. DSE, elemento de secuencia en sentido 3′.

La poliadenilación estabiliza el ARNm contra la degradación y también

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favorece su salida del núcleo al citosol. El uso de sitios de poliadenilación alternativos puede alterar la estabilidad del ARNm (fig. 6.10) y la secuencia de aminoácidos de la proteína (fig. 6.11). Mediante el uso de señales de poliadenilación alternativas, la transcripción de la mayor parte de los genes da lugar a múltiples pre-ARNm. La elección del sitio señal utilizado depende de la secuencia de nucleótidos exacta de la señal, de otros elementos del pre-ARNm y de las proteínas que se unen al pre-ARNm.

FIG. 6.10 El uso de un sitio de poli(A) en sentido 5′ lleva a la finalización de la transcripción y a una región no traducida (UTR) 3′ acortada. La UTR 3′, más larga, puede contener secuencias que regulan la semivida del ARNm. Los exones se explican en la sección 1.3.

FIG. 6.11 El uso de poli(A) en sentido 5′ lleva a la finalización de la transcripción y a una reducción del número de exones, lo que altera la estructura de la proteína. Los cuadros sólidos corresponden a regiones codificadoras de proteínas. Se obtiene un resultado similar si el sitio de poli(A) en sentido 5′ está en el interior de un intrón. Los exones e intrones se explican en la sección 3.3.

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3.3. Corte y empalme del pre-ARNm El corte y empalme (splicing) forma parte del procesado del pre-ARNm que da lugar al ARNm maduro. Los espliceosomas eliminan los intrones y después unen los exones restantes. Un pre-ARNm humano típico contiene aproximadamente 25 exones de ∼150 nucleótidos cada uno, además de 24 intrones de ∼2.000 nucleótidos cada uno (longitud total ∼50.000 nucleótidos). El corte y empalme del pre-ARNm comienza durante la transcripción. Algunas proteínas pueden unirse a la ARN polimerasa, aunque la mayor parte del corte y empalme tiene lugar después de que la ARN polimerasa se haya liberado del ADN. El corte y empalme está determinado por los siguientes elementos del preARNm (fig. 6.12): donante del punto de corte y empalme (5′), aceptador del punto de corte y empalme (3′), tracto de polipirimidina en sentido 5′ del aceptador de corte y empalme, punto de ramificación del corte y empalme, potenciadores del corte y empalme y silenciadores del corte y empalme.

FIG. 6.12

Requisitos básicos para el corte y empalme del pre-ARNm. La figura muestra la parte 5′ de un pre-ARNm.

La secuencia consenso del donante de corte y empalme es GU, y la secuencia consenso del aceptador de corte y empalme es AG. Los nucleótidos que flanquean estas secuencias afectan a la elección del punto de corte y empalme. El espliceosoma nuclear, que realiza casi todo el corte y empalme del ARN, está formado por un complejo dinámico que durante el transcurso del proceso incluye cinco ARNnp y más de 300 proteínas. Como los ARNnp del espliceosoma catalizan el corte y empalme propiamente dicho, el espliceosoma (igual que el ribosoma) es una ribozima. Además de donantes, aceptadores y espliceosomas, el corte y empalme es dirigido por secuencias denominadas potenciadores del corte y empalme

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exónico, además de silenciadores del corte y empalme intrónico. Las proteínas SR reconocen y se unen a los potenciadores y favorecen el corte y empalme. Por el contrario, los complejos de hnRNP (complejos ARNproteína) se unen a los silenciadores y bloquean el corte y empalme. Los exones se cortan y empalman juntos solo en la secuencia en la que aparecen en el pre-ARNm, aunque es posible que se omitan uno o más exones. Durante el corte y empalme, los extremos de los exones siempre están unidos al espliceosoma, es decir, nunca están libres. Durante el corte y empalme se deposita un complejo de unión al exón (EJC, exon junction complex) multiproteínico sobre el ARNm cortado y empalmado en sentido 5′ de todas las uniones. Los EJC son necesarios para la salida del ARNm del núcleo. En el citosol los EJC se eliminan durante la primera tanda de traducción, aunque si hay un codón finalizador cerca de un EJC, el ARNm entra en la degradación del ARNm mediada por mutaciones finalizadoras (v. sección 3 en cap. 7). Las mutaciones adquiridas de los factores de corte y empalme (proteínas) aparecen con una frecuencia especialmente elevada en el síndrome mielodisplásico (SMD), que se caracteriza por una menor producción de eritrocitos y un mayor riesgo de aparición de leucemia aguda. Las mutaciones de los sitios donantes o aceptadores del corte y empalme pueden alterar el proceso y también pueden inducir que se produzca en sitios de corte y empalme crípticos que normalmente no se utilizan. Además, una mutación puede crear un nuevo sitio de corte y empalme. Las mutaciones frecuentemente causan tan solo un desplazamiento parcial en el corte y empalme y así permiten generar dos o más ARNm. Un ejemplo de un desplazamiento parcial para utilizar un nuevo sitio aceptador de corte y empalme es una forma de β-talasemia que se originó en la cuenca del Mediterráneo (v. fig. 17.3).

3.4. Corte y empalme alternativo del pre-ARNm La mayor parte de los ARN que contienen dos o más exones sufren corte y empalme alternativo, que incrementa mucho la diversidad de las proteínas que se pueden sintetizar. Mediante este proceso se pueden intercambiar, añadir o eliminar partes de una proteína. Existen cuatro tipos esenciales de corte y empalme alternativo: uso de un sitio alternativo en sentido 5′, uso de un sitio alternativo en sentido 3′, inclusión/omisión de exones en cassette, y retención de intrones (fig. 6.13).

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FIG. 6.13

Mecanismos básicos del corte y empalme alternativo.

El corte y empalme del transcrito de ARN procedente del gen de los receptores de glucocorticoides es un ejemplo del uso de un aceptador de corte y empalme alternativo (v. fig. 6.14). Este caso da lugar a receptores que se unen o no se unen a un glucocorticoide.

FIG. 6.14

Corte y empalme alternativo del pre-ARNm del receptor de glucocorticoides. Los cuadros sólidos corresponden a las secuencias traducidas. El exón 9 codifica el dominio de unión al glucocorticoide. No se muestran los exones 1–7. (Hay una forma adicional de ARNm del GRα con una región no traducida 3′ más corta por el uso de un sitio de poliadenilación alternativo en sentido 5′, que no se muestra.)

En resumen, un gen es un segmento de ADN que se transcribe a ARN, y después de la transcripción se eliminan los intrones del ARN, al tiempo que se retienen los exones (fig. 6.15). Como se explica en el capítulo 7, un ARNm se traduce en una proteína, pero no se traducen el extremo 5′, el extremo 3′, ni la cola de poli(A). Los extremos no traducidos se denominan región no traducida 5′ (UTR 5′, untranslated region) y región no traducida 3′ (UTR 3′).

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FIG. 6.15

Del gen al ARN y a la proteína.

Un único gen puede dar lugar a diversas proteínas gracias a los sitios alternativos de inicio de la transcripción y poliadenilación, el corte y empalme alternativo (v. secciones 2 y 3), los sitios alternativos de inicio de la traducción y las modificaciones postraduccionales (v. secciones 3 y 4 en cap. 7).

3.5. Salida del ARNm hacia el citosol Las partículas de ribonucleoproteínas mensajeras (complejos de ARNm y proteínas) salen del núcleo a través de complejos de poros nucleares (NPC), que tachonan una capa de retículo endoplasmático alrededor del núcleo (fig. 6.16). Para salir a través de los NPC, diversos factores de salida del ARN deben unirse al complejo del ARNm y sus proteínas asociadas (p. ej., el complejo de unión al revestimiento, proteína de unión a poli(A) y EJC).

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FIG. 6.16

Salida de los complejos de partículas de ribonucleoproteína mensajera (RNPm) desde el núcleo. Hacen falta proteínas adicionales para dirigir el complejo RNPm a través del complejo del poro nuclear. RE, retículo endoplasmático.

3.6. Degradación del ARNm La calidad del pre-ARNm y el ARNm está muy controlada. Los ARN que no cumplen los requisitos son degradados, y hay un recambio continuo de todos los ARNm. En el citosol, el casquete del extremo 5′ y la cola de poli(A) del extremo 3′, unidos a proteínas, permiten que sobreviva el ARNm. El ARNm es degradado primero mediante acortamiento de la cola de poli(A) por desadenilasas, lo que produce adenosina monofosfato. El ARN resultante puede ser degradado después en dirección 3′→5′ por el exosoma, un gran complejo proteínico, hasta que solo queda el casquete m7GpppN, que es degradado por una enzima específica. Otra posibilidad es que, después de la eliminación de la cola de poli(A), el ARN puede ser degradado primero mediante eliminación del casquete del extremo 5′ y luego por una exonucleasa 5′→3′ (Xrn1). Las dos vías de degradación del ARN están sometidas al control activador o inhibidor de muchas proteínas.

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Resumen ■ El ADN de la heterocromatina está muy empaquetado y no se transcribe. El ADN de la eucromatina se puede transcribir. ■ La metilación del ADN en las C de los CpG, el reconocimiento de los CpG metilados y la metilación de las histonas favorecen la formación de heterocromatina. La metilación del ADN es la base de la herencia epigenética. Los CpG son metilados como parte del desarrollo, la diferenciación y la inactivación de los cromosomas X cuando están presentes dos o más cromosomas X. Los segmentos de ADN que contienen una fracción relativamente elevada de CpG se denominan islas CpG. La mayor parte de las islas CpG no están metiladas. ■ En las células tumorales, la metilación excesiva del ADN suele ser responsable de la menor transcripción de los genes que codifican los supresores tumorales. ■ La acetilación de las histonas, catalizada por lisina acetiltransferasas, hace que el ADN sea más susceptible de ser transcrito. En la práctica clínica se consigue un efecto similar con inhibidores de las histona desacetilasas (HDAC). Entre estos inhibidores, el ácido valproico se utiliza para tratar las crisis convulsivas, mientras que el vorinostat, la romidepsina, el belinostat y el panobinostat se utilizan para tratar algunas formas de linfoma. ■ Un gen se suele definir como un segmento de ADN que se transcribe. La cadena plantilla de ADN se transcribe en dirección 3′→5′, de modo que el ARN se sintetiza en dirección 5′→3′. El ARN resultante tiene la misma secuencia que la cadena codificante, excepto que tiene U en lugar de T. ■ Genes vecinos pueden estar orientados en direcciones opuestas. De las dos cadenas de ADN complementarias que componen un cromosoma, una cadena de ADN es la cadena codificante solamente de los genes que están orientados en una dirección particular, mientras que la otra cadena contiene las cadenas codificantes de genes que están orientados en la dirección opuesta. ■ En sentido 5′ del gen hay una región promotora que contiene un promotor nuclear. Para que tenga lugar la transcripción, los factores de transcripción se deben unir a elementos promotores en la región promotora, y los factores de transcripción generales (GTF) se deben unir al promotor nuclear. Algunos factores de transcripción están activos solo cuando están unidos a un ligando, como un esteroide. Una vez que se ha ensamblado el complejo de inicio, la ARN polimerasa sintetiza ARN a partir de la plantilla de ADN. ■ Algunos fármacos de uso clínico, como glucocorticoides, estrógenos, progestágenos, fibratos y ácido retinoico, activan factores de

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transcripción. ■ Durante la transcripción, el ARN transcrito recibe un casquete de 7metilguanosina trifosfato y una cola de poli(A) de 50-100 nucleótidos. ■ Tanto durante la transcripción como después, los espliceosomas eliminan intrones y unen exones. El primer exón contiene la UTR 5′ y el último exón contiene la UTR 3′. El corte y empalme alternativo se debe al uso de un donante o aceptador de corte y empalme alternativo, o a omisión de exones o retención de intrones. Un sitio de corte y empalme críptico es un sitio que normalmente no se utiliza para el proceso, aunque se usa en situaciones especiales, como cuando hay una nueva mutación. ■ El ARNm maduro con casquete, complejo de unión al casquete, complejos de unión a los exones (EJC), cola de poli(A) y proteína de unión a poli(A) se une a más proteínas, y después sale hacia el citosol a través del complejo del poro nuclear (NPC).

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Lecturas recomendadas ■ de Klerk E, ‘t Hoen PA. Alternative mRNA transcription, processing, and translation: insights from RNA sequencing. Trends Genet. 2015;31:128–139. ■ Houseley J, Tollervey D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 2009;136:763–776. ■ Matera AG, Wang Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15:108–121. ■ Meijsing SH. Mechanisms of glucocorticoid-regulated gene transcription. Adv Exp Med Biol. 2015;872:59–81. ■ Wickramasinghe VO, Laskey RA. Control of mammalian gene expression by selective mRNA export. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015;16:431–442.

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CAPÍTULO 7

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Traducción y procesado postraduccional de las proteínas Sinopsis ■ Como se detalla en el capítulo 6, la secuencia de nucleótidos del ADN da lugar a un ARNm que tiene en esencia la secuencia complementaria. ■ En la traducción, los ribosomas sintetizan proteínas siguiendo las reglas del código genético y la información genética contenida en el ARNm. La secuencia del ARNm se lee en unidades de tres nucleótidos llamadas codones. Cada codón especifica un aminoácido particular o una señal para poner fin a la síntesis de la proteína. ■ Las aminoacil-ARNt sintetasas cargan cada ARNt con el correspondiente aminoácido, generándose así aminoacil-ARNt. ■ Los ribosomas rastrean el ARNm hasta detectar un codón de inicio para comenzar la síntesis de proteínas. En cada codón, el ribosoma que realiza la traducción empareja la secuencia del codón con un aminoacilARNt específico y cataliza la formación de un enlace peptídico. ■ En los seres humanos, si un péptido recién sintetizado contiene una secuencia señal, los ribosomas se anclan al retículo endoplasmático (RE) e introducen en él la cadena peptídica en crecimiento a través de un canal peptídico. Tan pronto como determinadas cadenas laterales de asparagina llegan a la luz del RE, son glucosiladas. La glucosilación puede influir en el plegamiento de las proteínas y posteriormente también en su distribución. Las bacterias no tienen RE. ■ Las proteínas se pliegan principalmente en el RE. Las chaperonas detectan las proteínas con plegamiento anómalo y las vuelven a plegar o las dirigen hacia su degradación. ■ Las proteínas se dirigen desde el RE hasta el aparato de Golgi en el interior de vesículas. En el aparato de Golgi las proteínas pueden sufrir modificaciones extensas y son sometidas a una clasificación adicional para su transporte en el interior de vesículas hacia partes específicas de la célula. ■ Muchos antibióticos de uso habitual alteran de forma selectiva la traducción en las bacterias.

Objetivos de aprendizaje Para dominar este tema, debería ser capaz de hacer lo siguiente:

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■ Describir los factores que determinan el inicio, la continuación y el final de la traducción. ■ Explicar por qué algunas mutaciones del ADN en la secuencia codificante no dan lugar a una proteína mutante. ■ Explicar por qué una inserción o deleción de una o dos bases habitualmente es una mutación con pérdida de función, y por qué la proteína mutante no se acumula en el tejido. ■ Enumerar los factores que determinan la velocidad general de síntesis de proteínas. ■ Enumerar los antibióticos que interfieren con la síntesis de proteínas y describir su mecanismo de acción. ■ Describir la síntesis de las proteínas de membrana. ■ Describir los factores que influyen en la distribución de las proteínas recién sintetizadas y su transporte a diferentes compartimentos subcelulares. ■ Describir las modificaciones postraduccionales habituales. ■ Analizar cómo las células controlan la calidad de las proteínas recién sintetizadas y las degradan si es necesario.

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1. Los codones y el código genético La secuencia de aminoácidos de una proteína está codificada en el ARN mensajero (ARNm) en forma de una secuencia de codones. Cada codón está formado por tres nucleótidos y codifica un aminoácido o una señal para poner fin a la traducción. El código genético describe la correlación entre codones y aminoácidos y permite predecir los efectos de algunas mutaciones sobre la secuencia de aminoácidos de una proteína. La traducción es el proceso de sintetizar proteínas en los ribosomas según la secuencia de nucleótidos del ARNm. Se incorporan a las proteínas 20 aminoácidos diferentes, cuya secuencia está codificada en el ARNm en forma de codones, que están formados por tres nucleótidos. Como hay cuatro bases diferentes, los codones de 3 nucleótidos pueden tener un total de 43 = 64 secuencias diferentes, suficiente para codificar 20 aminoácidos (los codones de 2 nucleótidos ofrecerían solo 42 = 16 opciones). El código genético es una lista de secuencias de codones y los correspondientes aminoácidos que se utilizan para la traducción (tabla 7.1). El codón AUG codifica Met e indica el inicio de la traducción. Los codones UAA, UAG y UGA son codones finalizadores (codones sin sentido, codones de terminación) y habitualmente ponen fin a la traducción. Tabla 7.1 Código genético para la información almacenada en los cromosomas Segunda base Primera base U

U Phe

C Ser

Leu C

Pro

A Tyr

G Cys

Finalizador

Finalizador Trp Arg

His Gln

A

Ile

G

Met Val

Thr

Ala

Asn

Ser

Lys

Arg

Asp

Gly

Glu

Tercera base U C A G U C A G U C A G U C A G

Para descodificar la cadena codificante del ADN, se debe sustituir U por T. El código genético de las mitocondrias difiere en que AGA y AGG son también codones finalizadores, UGA codifica Trp, y AUU y AUA codifican Met.

Como se utilizan todas las posibles secuencias de codones, codones

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diferentes pueden codificar el mismo aminoácido, es decir, el código genético está degenerado. La cadena codificante del ADN tiene la misma secuencia que el ARNm que se genera a partir de la cadena matriz, excepto que contiene T en lugar de U. La cadena codificante y el ARNm son complementarios a la cadena matriz (v. sección 2 en cap. 6). Las mutaciones silentes (sustituciones sinónimas) son mutaciones que no modifican la secuencia de aminoácidos porque el código genético está degenerado. Sin embargo, las mutaciones silentes pueden afectar al corte y empalme o a la estabilidad del ARNm y por ello pueden ser patógenas. Las mutaciones sin sentido o finalizadoras son mutaciones que llevan a la formación de un codón finalizador. Puede producirse solo una pequeña cantidad de la proteína alterada porque el codón de finalización prematura lleva a la destrucción del ARNm mediante degradación del ARNm mediada por mutaciones finalizadoras (v. sección 3). Las mutaciones de sentido equivocado llevan a la sustitución de un aminoácido por otro. Las sustituciones de aminoácidos con propiedades muy diferentes (sustituciones no conservadoras; p. ej., sustitución de un aminoácido hidrófobo por un aminoácido con carga) tienen efectos más graves que las sustituciones de aminoácidos con propiedades similares (sustituciones conservadoras). Como cada codón contiene tres nucleótidos, teóricamente hay tres marcos de lectura del ARNm diferentes. El marco de lectura real suele estar determinado por la primera vez que aparece la secuencia de nucleótidos AUG (que codifica Met) en un contexto de secuencia particular (v. sección 3). Los marcos de lectura alternativos habitualmente contienen codones finalizadores con una frecuencia relativamente elevada (estadísticamente, ∼1:20 codones aleatorios es un codón finalizador). Como el marco de lectura utilizado fisiológicamente tiene menos codones finalizadores que los otros dos marcos de lectura, a veces se denomina marco abierto de lectura. Las mutaciones por desplazamiento del marco de lectura son inserciones o deleciones de nucleótidos que no son divisibles por 3 y, por lo tanto, modifican el marco de lectura de parte del ARNm. Como los marcos de lectura alternativos tienen frecuentes codones finalizadores, una mutación por desplazamiento del marco de lectura generalmente lleva al truncado de la proteína y a la eliminación del ARNm mediante degradación del ARNm mediada por mutaciones finalizadoras (v. sección 3). A excepción de las mitocondrias, que tienen su propia maquinaria para la traducción y emplean una forma modificada del código genético (v. tabla 7.1), todos los organismos utilizan el mismo código genético (es decir, el código es universal). En consecuencia, las bacterias modificadas genéticamente, por ejemplo, se pueden utilizar de una manera sencilla para fabricar proteínas humanas (proteínas recombinantes) que se podrán usar como fármacos biológicos (p. ej., insulina, eritropoyetina). Sin embargo, el procesado postraduccional de las proteínas eucariotas en procariotas puede ser

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incompleto o incorrecto y por ello puede ser necesaria una manipulación adicional.

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2. ARN de transferencia Como preparación para la síntesis de proteínas, las aminoacil-ARNt sintetasas cargan los ARNt con los correspondientes aminoácidos para formar aminoacil-ARNt. Cada ARNt contiene un anticodón que leerá el correspondiente codón del ARNm. El anticodón de cada ARNt debe emparejar los dos primeros nucleótidos de un codón siguiendo la regla de emparejamiento de bases común (Watson-Crick); sin embargo, hay flexibilidad en el emparejamiento del tercer nucleótido debido a que el emparejamiento de bases es oscilante. Los ARNt son moléculas bifuncionales que leen codones seleccionados y portan un aminoácido que se corresponde con ellos. Aunque se incorporan a las proteínas 20 aminoácidos diferentes, y hay 61 codones que codifican esos aminoácidos, hay más de 500 ARNt diferentes. Los ARNt están formados por ∼80 nucleótidos, y todos ellos se pliegan en una estructura terciaria en forma de L (fig. 7.1). La secuencia de cada ARNt está codificada en los cromosomas y en el ADN mitocondrial (v. fig. 23.8). Cada ARNt es sintetizado por la transcripción de un gen y posteriormente es procesado. El extremo 3′ de todos los ARNt se prolonga con la secuencia CCA-3′. Los nucleótidos de los ARNt sufren modificaciones extensas, en su mayor parte mediante metilación. Se pueden editar mediante desaminación algunas adenosinas para dar lugar a inosinas. En el ARNt con forma de L, un extremo contiene tres nucleótidos que son complementarios a los tres nucleótidos del codón; esta región se denomina anticodón.

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FIG. 7.1 Estructura del ARNtSec humano. (Basado en el archivo de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 3A3A de Itoh Y, Chiba S, Sekine SI, Yokoyama S. Crystal structure of human selenocysteine tRNA. Nucleic Acids Res. 2009;37:6259-6268.)

Generalmente, cada anticodón del ARNt puede leer múltiples codones diferentes debido al emparejamiento de bases oscilante. Un anticodón tiene que coincidir con los dos primeros nucleótidos de cada codón del ARNm según las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick (A-U, C-G), pero hay flexibilidad con el tercer nucleótido del codón, que puede ser A, C o U y pese a todo unirse suficientemente bien a la inosina (I, una A editada; v. más arriba) del anticodón; además, G y U pueden formar un par de bases oscilante. A modo de ejemplo de un par de bases oscilante, el anticodón del ARNt-glicina tiene la secuencia 5′-ICC, que puede emparejarse con tres codones: GGA, GGC y GGU. Los ARNt reciben el nombre del aminoácido con el que están cargados y de los codones asignados a este aminoácido. Por ejemplo, ARNtCys está cargado con cisteína y reconoce los codones de cisteína. El codón de inicio ARNtiMet se

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utiliza selectivamente para iniciar la síntesis de proteínas, y el codón elongador ARNtMet se utiliza durante la elongación de la cadena. Aunque habitualmente hay múltiples ARNt que codifican el mismo aminoácido, en este libro no se va a distinguir más entre estos ARNt. Las aminoacil-ARNt sintetasas utilizan ATP para emparejar el extremo CCA-3′ de un ARNt con el correspondiente aminoácido. Para cada aminoácido hay una aminoacil-ARNt sintetasa. Las aminoacil-ARNt sintetasas reconocen los ARNt de diversas maneras, habitualmente por la secuencia de nucleótidos del segmento aceptador de aminoácidos (señalado en color rojo en la fig. 7.1) y de la región del anticodón. Para algunos aminoácidos, como Leu, hacen falta múltiples ARNt para leer todos los codones. En estas circunstancias, la aminoacil-ARNt sintetasa (en este caso, leucil-ARNt sintetasa) acepta múltiples ARNtLeu como sustratos. Estos ARNt isoaceptadores difieren en los nucleótidos del anticodón y en otras regiones de la estructura con forma de L. Las aminoacil-ARNt sintetasas para leucina, isoleucina, valina, treonina, alanina y fenilalanina contienen una función de edición (corrección de errores). Estas sintetasas pueden acilar su ARNt con el aminoácido incorrecto. Para compensar esta situación, estas enzimas utilizan un segundo sitio catalítico para eliminar los aminoácidos incorrectos. La selenocisteína (Sec, v. fig. 9.2), un aminoácido que contienen algunas proteínas, se sintetiza sobre el ARNtSec. Primero, la seril-ARNt sintetasa aminoacila el ARNtSec con serina. Después una enzima fosforila la serina. Una segunda enzima intercambia el fosfato por un grupo selenol (–SeH) para dar selenocisteinil-ARNtSec. El ARNtSec tiene la característica exclusiva de que es portador del anticodón 5′-UCA-3′, que es complementario del codón finalizador UGA. La selenocisteína está codificada en el ARNm por una combinación de un codón finalizador UGA y una secuencia de inserción de selenocisteína (SECIS) en sentido 3′. El antibiótico ácido seudomónico (mupirocina) inhibe la síntesis de proteínas mediante la inhibición de la isoleucil-ARNt sintetasa en las bacterias. Se suele utilizar para tratar infecciones por Staphylococcus aureus resistente a meticilina.

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3. Los ribosomas traducen el ARNm en una proteína Los ribosomas son grandes complejos de ARN-proteína que se unen al ARNm, leen el ARNm, aceptan ARNt que coincidan con los codones del ARNm y catalizan la formación de enlaces peptídicos entre los aminoácidos unidos a los ARNt. El primer aminoácido de una proteína suele ser metionina; sin embargo, habitualmente se elimina poco después de la traducción. Las proteínas que contienen una secuencia señal se transfieren al RE durante la síntesis. La degradación del ARN mediada por mutaciones finalizadoras garantiza que no se traduzcan los ARNm que contienen codones de finalización prematura. Los micro-ARN interfieren con la traducción. La síntesis de proteínas aumenta después de una comida variada y disminuye cuando hay estrés, una infección vírica o privación de nutrientes. Varios antibióticos utilizados en la práctica clínica bloquean la traducción en las bacterias, aunque no lo hacen de forma apreciable en los seres humanos. La producción de ARNm, la estructura del casquete 5′ y la cola de poli(A) se describen en las secciones 2 y 3 del capítulo 6. Las características del ARNm que son importantes para la traducción se muestran en la figura 7.2.

FIG. 7.2

Estructura de un ARNm típico.

Cada ribosoma humano está formado por cuatro ARNr y ∼80 proteínas. El mayor ARNr es una ribozima que cataliza la formación de enlaces peptídicos. Un ribosoma está formado por una subunidad pequeña y una subunidad grande. En el citosol, un complejo de factores de inicio de la traducción, MettRNAiMet (ARNt iniciador de metionina acilado con metionina) y la subunidad pequeña de un ribosoma se une al casquete 5′ de un ARNm, comprueba que tenga una cola de poli(A), rastrea el ARNm desde el casquete 5′, encuentra el codón de inicio (casi siempre AUG) y comienza la traducción.

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Este codón AUG a menudo está flanqueado por ACC en el lado 5′ y G en el lado 3′. Si los nucleótidos que flanquean el codón AUG no concuerdan suficientemente bien, la traducción comienza en un AUG adecuado que esté más alejado del casquete. La insulina y otros factores de crecimiento incrementan la síntesis de proteínas en parte porque llevan a una mayor unión de un factor de inicio al casquete 5′ del ARNm. La secuencia entre el casquete 5′ y el codón de inicio del ARNm se denomina región no traducida 5′ (UTR 5′, 5′ untranslated region; v. fig. 7.2). A veces la UTR 5′ contiene un elemento regulador, como un elemento de respuesta al hierro (v. sección 3 en cap. 15). Una vez que se ha encontrado el codón de inicio, la subunidad grande del ribosoma se une al ARNm. Un factor de elongación (eIF5A) lleva el ARNt aminoacilado al codón siguiente al codón de inicio. Si el codón y el anticodón coinciden, se hidroliza guanosina trifosfato (GTP) y el ARNt aminoacilado sufre un cambio conformacional denominado acomodación. Este cambio de estructura desplaza el aminoácido que hay sobre el ARNt al sitio catalítico peptidiltransferásico del ribosoma y lo alinea con la Met del ARNt iniciador. Se forma un nuevo enlace peptídico por el ataque nucleofílico del grupo amino del aminoácido entrante al grupo carbonilo de la metionina del ARNt iniciador (fig. 7.3). El nuevo enlace peptídico se forma de tal manera que Met está ahora unida al aminoácido del ARNt recién añadido.

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FIG. 7.3 Síntesis de péptidos en los ribosomas. El grupo hidroxilo del extremo 3′ del ARNt entrante es esterificado con el grupo carboxilo de su correspondiente aminoácido. El grupo amino libre de este aminoácido pone en marcha un ataque nucleofílico sobre el grupo carboxilo del aminoácido precedente de la cadena peptídica en crecimiento.

A continuación, un factor de elongación diferente (EF-G) se une al ribosoma, se hidroliza GTP y el ribosoma se desplaza un codón sobre el ARNm en dirección 5′→3′. El ARNt que ahora porta un dipéptido también se desplaza en el ribosoma. Un nuevo ARNt aminoacilado coincidente se une al ribosoma, y el ARNt iniciador desacilado («vacío») sale del ribosoma. La repetición de estos procesos lleva a la elongación adicional de la cadena peptídica siguiendo la información codificada en el ARNm. Cada ribosoma forma aproximadamente de uno a dos enlaces peptídicos por segundo. La insulina favorece la síntesis de proteínas en parte mediante el aumento de la actividad del factor de elongación. Una vez que el ribosoma llega a un codón finalizador (codón de terminación), un factor liberador (de naturaleza proteínica) reconoce el

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codón finalizador. Junto con otro factor liberador libera la cadena peptídica del ribosoma. Con ayuda de un factor de reciclado del ribosoma y otras proteínas, el ribosoma se disocia después para dar la subunidad pequeña y la subunidad grande. El segmento de ARNm entre el codón finalizador y la cola de poli(A) se denomina UTR 3′. Igual que la UTR 5′, la UTR 3′ también puede contener secuencias reguladoras que afectan a la velocidad de traducción del ARNm. Esto también se aplica a los elementos de respuesta al hierro. La UTR 3′ también puede contener una secuencia que lleva a la degradación rápida del ARNm, lo que permite que las células expresen determinadas proteínas tan solo durante un breve periodo de tiempo. Los ARNm que contienen codones de finalización prematura (terminación) pueden ser destruidos por la vía clásica de degradación mediada por mutaciones finalizadoras (NMD). Cuando el ARNm llega por primera vez al citosol, todos los sitios de corte y empalme exón-exón se marcan ∼22 nucleótidos en sentido 5′ por complejos de unión al exón. Si un ribosoma se detiene más de ∼50 nucleótidos en sentido 5′ respecto a una unión exón-exón, el ARNm entra en NMD. En la NMD se eliminan el casquete 5′ y la cola de poli(A) 3′, y las exonucleasas degradan el ARNm de ambos extremos. Por el contrario, si un ribosoma se mueve suavemente a lo largo del ARNm sin detenerse, se eliminan los complejos de unión a los exones, y el ARNm es ahora una plantilla adecuada para la traducción. Hay otras diversas vías que reconocen los ARNm anormales, que no se analizan en este texto. Para la síntesis de muchas proteínas, la pérdida del ARNm anormal, que puede llevar a haploinsuficiencia, es un mal menor en comparación con la producción de una proteína truncada, que puede tener un efecto dominante negativo (v. cap. 5). Se estima que a pesar de la degradación de los ARNm con codones de finalización prematura, el ∼10% de todas las enfermedades hereditarias está causado por mutaciones finalizadoras. Dos metionina aminopeptidasas diferentes eliminan la Met del extremo N-terminal de la mayor parte de proteínas nacientes cuando salen del ribosoma (es decir, antes de que se plieguen las proteínas). Para que estas aminopeptidasas escindan el residuo de Met, el segundo aminoácido de la proteína naciente no debe ser voluminoso. Las proteínas empiezan a plegarse en estructuras secundarias durante la traducción. Las hélices α son suficientemente pequeñas como para poder empezar a formarse en el túnel de salida de los ribosomas. Sin embargo, las proteínas pueden adquirir una estructura terciaria (v. cap. 9) solo después de salir de los ribosomas. Un único ARNm a menudo contiene muchos ribosomas que lo recorren. Además, el casquete 5′ y la cola de poli(A) 3′ de un ARNm se mantienen unidos por la acción de los factores de inicio. Esto facilita el reconocimiento de los dos extremos del ARNm y que los ribosomas se vuelvan a ensamblar sobre el ARNm. Los micro-ARN (miARN) son ARN de ∼22 nucleótidos de longitud que

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favorecen la degradación del ARNm e inhiben la traducción. Los miARN se unen a segmentos complementarios del ARNm. Los seres humanos producen más de 1.000 miARN diferentes. Cada miARN se puede unir a varios ARNm diferentes, en parte porque no es necesario que un miARN coincida exactamente con la secuencia del ARNm. Aproximadamente la mitad de todos los ARNm están sometidos a regulación por un miARN. Los miARN se combinan con la proteína Argonaute para formar el núcleo de un complejo silenciador inducido por miARN, miRISC (fig. 7.4). Los miARN reducen la síntesis de proteínas principalmente porque favorecen la degradación del ARNm. Los miARN y Argonaute se unen primero a la UTR 3′ de un ARNm y después atraen una proteína de andamiaje que, a su vez, se une a enzimas que eliminan del ARNm la cola de poli(A) y el casquete 5′. Posteriormente, una exonucleasa 5′ del citosol degrada el ARNm desprovisto de casquete y desadenilado. La inhibición directa de la traducción podría deberse a la interferencia con los factores de inicio.

FIG. 7.4

Degradación del ARNm inducida por miARN.

La síntesis de proteínas se ralentiza claramente en respuesta a condiciones de privación de nutrientes (especialmente de aminoácidos y glucosa), infecciones víricas y diversas formas de estrés celular. Estas situaciones

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ralentizan la traducción reduciendo la concentración de aminoacil-ARNt disponibles para los ribosomas. Los tres ejemplos siguientes ilustran cómo funciona esta regulación: ■ Las células que sufren carencia de un único aminoácido detienen la síntesis de proteínas. ■ Los precursores de eritrocitos que sintetizan de forma activa hemoglobina (v. cap. 16) dedican casi toda su síntesis de proteínas a la producción de globinas. Si hay escasez de hemo (el grupo prostético de las globinas) (p. ej., por ferropenia), la velocidad de la síntesis de proteínas disminuye y está limitada por la producción de hemo. ■ Muchos virus que infectan células humanas producen grandes cantidades de ARN bicatenario. La mayor parte de las células humanas contiene una cinasa que reconoce el ARN bicatenario e inactiva un factor de inicio de la síntesis de proteínas. De esta manera se bloquea la traducción en una célula infectada por un virus, lo que impide la síntesis de las proteínas víricas. Los interferones tipo I, que son proteínas producidas endógenamente en respuesta a una infección vírica o que se administran como fármacos, pueden estimular la misma cinasa dependiente de ARN bicatenario. Algunos virus, como los virus gripales, del herpes simple y de la inmunodeficiencia humana, han desarrollado mecanismos para antagonizar el bloqueo de la síntesis de proteínas dirigido por cinasas. Algunos ARNm contienen codones CUG para Leu, que se utilizan para iniciar la síntesis de proteínas cuando el inicio de la traducción mediado por los codones AUG de Met está bloqueado debido a estrés o una infección. Esto se aplica a los ARNm de las proteínas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad, que presentan a los linfocitos T citotóxicos péptidos cortos, incluyendo péptidos de patógenos. Las proteínas sintetizadas en los ribosomas del citosol se pueden reubicar en diversos compartimentos subcelulares dependiendo de sus secuencias peptídicas específicas. Por ejemplo, la presencia de una secuencia de localización nuclear facilita la translocación de la proteína al núcleo; una secuencia de localización mitocondrial facilita la translocación de la proteína a las mitocondrias, y una secuencia de localización en los peroxisomas envía la proteína a los peroxisomas. Los complejos transportadores de proteínas translocasa de la membrana externa (TOM) y translocasa de la membrana interna (TIM) controlan la entrada de más de 1.000 proteínas a las mitocondrias a través de las membranas externa e interna. El gradiente electroquímico de las proteínas de las mitocondrias (v. sección 1.2 en cap. 23) aporta la energía para la translocación de las proteínas.

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Aproximadamente un tercio de todas las proteínas contienen una secuencia señal (secuencia guía, preprosecuencia) y, por lo tanto, se sintetizan mediante transferencia de la cadena peptídica en crecimiento al RE (fig. 7.5). Este grupo incluye proteínas que acaban en la membrana plasmática, en los lisosomas o en vesículas secretoras. Entre los ejemplos se incluyen los siguientes: receptores acoplados a proteínas G en la membrana plasmática (v. cap. 33), maltasa ácida en los lisosomas (v. cap. 24) e insulina en vesículas secretoras (v. cap. 26).

FIG. 7.5 Algunos ribosomas se unen al retículo endoplasmático. Imagen de parte de un fibroblasto en microscopia electrónica de transmisión. Las flechas muestran los ribosomas que están unidos a la membrana del retículo endoplasmático. Mi, mitocondria; RER, retículo endoplasmático rugoso. El círculo indica ribosomas libres. (Cortesía del Dr. B.J. Crawford.)

Cuando una cadena peptídica en crecimiento sale del ribosoma y contiene una secuencia señal, se une a ella una partícula de reconocimiento de señales (SRP) (fig. 7.6). La SRP está formada por un ARN y seis proteínas. Una parte de la SRP llega al ribosoma y se ubica en el sitio de unión al factor de elongación, se empareja con el ARNr y detiene transitoriamente la traducción. La SRP (con el ribosoma unido) se une después al receptor de SRP en la superficie del RE. Esto facilita la unión del ribosoma a un canal (translocón) que permite que la cadena peptídica en crecimiento sea transferida al RE una vez que se reinicie la traducción, debido a la salida de la SRP.

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FIG. 7.6

Transferencia de una cadena peptídica en crecimiento hacia el interior del retículo endoplasmático. RE, retículo endoplasmático; OST, oligosacariltransferasa; SRP, partícula de reconocimiento de señales, que añade un glucano (v. sección 4.2).

Las proteínas que son sintetizadas mediante la transferencia de la cadena peptídica en crecimiento al RE se pueden transferir por completo al RE, o se pueden insertar parcialmente en la membrana del RE. Las proteínas destinadas a ser segregadas se transfieren por completo al RE, y el péptido señal se escinde generalmente por la acción de una peptidasa señal. Debido a la presencia de secuencias internas de inicio y finalización de la transferencia, se pueden insertar en la membrana del RE múltiples secuencias transmembranarias de una proteína de membrana. Por ejemplo, los receptores acoplados a proteínas G atraviesan siete veces la membrana plasmática (v. cap. 33). (En la membrana del RE, el péptido señal es degradado por la peptidasa del péptido señal.) Los ribosomas de las mitocondrias (mitorribosomas) difieren claramente de los ribosomas del citosol (y también de los de las bacterias). Los mitorribosomas traducen solo los 13 ARNm que son codificados por el ADN mitocondrial (ADNmt; v. fig. 23.8) y contienen solo dos ARNr (ambos codificados por el ADNmt). Aunque las ∼80 proteínas de los mitorribosomas están codificadas en el núcleo, se sintetizan en el citosol y después entran en las mitocondrias, solo aproximadamente la mitad de estas proteínas son las mismas que las que aparecen en los ribosomas del citosol. Los mitorribosomas utilizan un código genético que difiere algo del que utilizan los ribosomas citosólicos (v. tabla 7.1). Los ARNm mitocondriales no contienen casquete 5′ y prácticamente no tienen UTR 5′. El codón de inicio es AUG para 9 de las 13 proteínas.

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En las mitocondrias, las proteínas de membrana también se pueden insertar en la membrana interna durante la traducción. Se conocen pocos detalles de este proceso. La traducción del ARNm en los organismos procariotas difiere de la traducción en el citosol de los seres humanos en aspectos importantes. En los procariotas, la subunidad pequeña de un ribosoma se une a una secuencia de Shine-Dalgarno conservada, que está en posición 5′ respecto al codón de inicio AUG. La metionina del ARNt de inicio está formilada (se añade un grupo formilo, –CHO; esto también sucede en las mitocondrias de los seres humanos) y después se elimina el grupo formilo mientras se mantiene en su lugar el primer residuo de metionina. Los factores de inicio, las proteínas del ribosoma, los factores de elongación y los factores de liberación de los organismos procariotas son distintos de los de los seres humanos. Diversas clases importantes de antibióticos inhiben la traducción de las bacterias, pero no de las células humanas: ■ Los aminoglucósidos, como estreptomicina, gentamicina, tobramicina y amikacina, interfieren con la descodificación del ARNm y la acomodación del ARNt entrante. En consecuencia, se insertan aminoácidos erróneos, y se inhibe la elongación de la cadena peptídica. Los aminoglucósidos tienen efectos adversos tóxicos sobre la función de los túbulos renales, y también sobre la audición y el equilibrio. ■ El cloranfenicol inhibe la elongación de la cadena de proteína interfiriendo con la actividad peptidiltransferásica de los ribosomas. ■ Los macrólidos, como eritromicina, telitromicina, azitromicina y claritromicina, interfieren con la síntesis de péptidos bloqueando el túnel por el que la cadena peptídica naciente sale del ribosoma.

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4. Modificación postraduccional Durante la síntesis, y después, las proteínas se pliegan y son procesadas. El plegamiento de las proteínas a veces se facilita por las chaperonas. Las proteínas se pueden modificar mediante proteólisis, unión de hidratos de carbono, lípidos o isoprenos, o por reacciones de oxidorreducción. Se pueden detectar las proteínas con plegamiento anómalo o mutantes y se pueden volver a plegar o degradar. Este control de calidad es muy importante en diversas enfermedades hereditarias.

4.1. Comentarios generales En el RE, conforme se pliegan las proteínas, la proteína disulfuro isomerasa cataliza la formación de enlaces disulfuro entre residuos de cisteína. La peptidilprolil isomerasa isomeriza los enlaces peptídicos cis y trans en los que participa la prolina (v. fig. 9.3). Las chaperonas son proteínas que facilitan el plegamiento de otras proteínas. Se encuentran en el núcleo, el citosol, el RE, las mitocondrias, la superficie celular y el espacio extracelular. La mayor parte de las chaperonas son proteínas del choque térmico, que originalmente se descubrieron porque se expresaban en cantidades elevadas cuando se exponían las células al calor. La mayor parte de las chaperonas utilizan ATP para facilitar el plegamiento y unirse a las proteínas con plegamiento anómalo para impedir su agregación, además de desplegar y volver a plegar las proteínas con plegamiento erróneo. Las chaperonas a menudo reciben la asistencia de múltiples cochaperonas. Muchos tumores sobreexpresan las chaperonas, lo que favorece la progresión tumoral y las metástasis. Las chaperonas reconocen sus dianas mediante diversos mecanismos, como determinadas secuencias de consenso peptídicas cortas y la hidrofobicidad de la superficie (se supone que los residuos hidrófobos quedan enterrados; v. cap. 9). La glucosilación (v. a continuación) puede guiar el plegamiento de las proteínas porque impide el acceso a determinadas conformaciones.

4.2. Glucosilación La N-glucosilación se produce dentro del RE sobre determinados residuos de asparagina de las proteínas nacientes durante la traducción. La oligosacariltransferasa (doliquil-difosfooligosacárido-proteína glucotransferasa) transfiere un glucano preformado de 14 residuos al nitrógeno de la cadena lateral de una asparagina en una secuencia de consenso (fig. 7.7). El complejo de la oligosacariltransferasa está unido al translocón que transfiere una proteína naciente al RE. La adición de un glucano hidrófilo voluminoso influye en el plegamiento de algunas proteínas.

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FIG. 7.7

N-glucosilación de la cadena lateral de asparagina de una proteína.

La síntesis del glucano de 14 residuos para la N-glucosilación comienza en el lado citosólico y finaliza en el lado luminal del RE (fig. 7.8). En la superficie externa del RE, dos residuos de N-acetilglucosamina (activados por uridina difosfato [UDP]) y cinco residuos de manosa (activados por guanosina difosfato [GDP]) se unen al dolicol-fosfato. El dolicol es un lípido que procede de la misma vía productora de isoprenos que el farnesil-PP, el geranilgeranilPP, la ubiquinona y el colesterol (v. fig. 29.4). El glucano resultante se voltea al lado luminal de la membrana del RE. Ahí, otros cuatro residuos de manosa y tres de glucosa (todos ellos activados por dolicol-P) se unen para generar el glucano de 14 residuos que contiene tres ramificaciones (todas ellas en residuos de manosa).

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FIG. 7.8

Síntesis de un glucano de 14 residuos para la N-glucosilación en el retículo endoplasmático. Dol, dolicol; Glc, glucosa; GlcNAc, N-acetilglucosamina; Man, manosa; P, fosfato; RE, retículo endoplasmático.

En el aparato de Golgi, los glucanos unidos a las proteínas sufren modificaciones extensas por una combinación de recorte de los residuos de

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glucosa y manosa; fosforilación, sulfación y acetilación de los residuos de azúcar existentes; y adición de nuevos residuos de azúcar, como Nacetilglucosamina, galactosa, fructosa y ácido neuramínico. El recorte de los residuos depende de que las chaperonas detecten una configuración adecuada de la proteína. Un ejemplo de una proteína segregada que se debe glucosilar es la eritropoyetina, que estimula la síntesis de eritrocitos (v. cap. 16). Para la producción de eritropoyetina humana recombinante (epoetina α), habitualmente se modifican mediante ingeniería genética células de mamíferos para producir la proteína eritropoyetina humana y glucosilarla, a fin de poder obtener una semivida útil desde el punto de vista farmacológico. La darbepoetina es un análogo de la eritropoyetina obtenido mediante ingeniería genética que contiene cinco glucanos unidos a N en lugar de tres y tiene una semivida tres veces mayor que la eritropoyetina humana recombinante cuando se administra por vía intravenosa. Se observan alteraciones de la N-glucosilación en algunos trastornos congénitos de la glucosilación (CDG). Un CDG puede deberse a una menor glucosilación en el RE o a un procesado anormal en el aparato de Golgi. Los CDG causan una amplia variedad de síntomas clínicos. Con una prevalencia de ∼1 de cada 20.000 personas, el PMM2-CDG (previamente CDG-Ia) es el CDG más prevalente. Se debe a homocigosidad o heterocigosidad compuesta de un alelo PMM2 defectuoso. El gen PMM2 codifica la fosfomanomutasa 2, que cataliza la siguiente reacción:

La manosa-1-fosfato normalmente se activa con GDP y después se añade al dolicol-PP-glucano en crecimiento para la producción de un glucano de 14 residuos en la luz del RE. Los pacientes afectados muestran un amplio espectro de manifestaciones y de edad de inicio. Generalmente tienen cierta discapacidad intelectual, pérdida de visión, neuropatía periférica y ataxia cerebelosa que dificulta la deambulación independiente. El diagnóstico suele basarse en encontrar una glucosilación anómala de la transferrina mediante isoelectroenfoque (la transferrina es una proteína que transporta hierro en la sangre; v. sección 4 en cap. 15). Cuando es positiva, a esta prueba le sigue la medición de la actividad de la fosfomanomutasa en leucocitos o fibroblastos. El único CDG para el que actualmente hay un tratamiento eficaz es el MPICDG (anteriormente CDG-Ib), que se trata con suplementos de manosa. El MPI-CDG se debe a la carencia de manosa-6-fosfato isomerasa, que cataliza la siguiente reacción:

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Esta reacción es un prerrequisito para la síntesis de GDP-manosa. La prueba de laboratorio más utilizada para detectar un CDG tipo I (que afecta a la N-glucosilación) es una prueba de la glucosilación de la transferrina. Los CDG conocidos están causados por mutaciones en más de 50 genes diferentes, y las secuencias de todos los exones de miles de personas (el ∼20% de los cuales resultaron ser portadores de un CDG) sugieren que la prevalencia general de los CDG heredados con un patrón autosómico recesivo es tal vez de ∼1 de cada 1.000. Este número implica que la mayor parte de los pacientes afectados actualmente no se diagnostican de CDG; como este campo es joven y algunos fetos afectados pueden no ser viables, es probable que esta hipótesis sea cierta. La O-glucosilación se produce en el aparato de Golgi sobre los grupos – OH de Ser y Thr y comienza con la adición de N-acetilgalactosamina (GalNAc), que se puede extender con N-acetilglucosamina, ácido Nacetilneuramínico o galactosa y, posteriormente, con estos y otros azúcares. Los proteoglucanos y las mucinas son ejemplos de proteínas que se modifican mediante O-glucosilación. Los proteoglucanos son abundantes en la matriz extracelular, donde absorben y distribuyen fuerzas de compresión, almacenan factores de crecimiento y se unen a factores de la coagulación (v. sección 2 en cap. 13). Las mucinas, que son producidas por muchos tipos de células epiteliales y a menudo son segregadas para formar el moco (p. ej., en el tubo digestivo y las vías respiratorias), contienen abundantes residuos de Ser y Thr que pueden experimentar O-glucosilación. La O-glucosilación es menos frecuente que la N-glucosilación, y los componentes de la O-glucosilación tienen mayor redundancia que los de la N-glucosilación. En consecuencia, los trastornos de la O-glucosilación son menos frecuentes que los de la N-glucosilación. Los trastornos de la O-glucosilación habitualmente son específicos de tejido o de órgano. Un ejemplo de un trastorno de este tipo es la hemoglobinuria paroxística nocturna (v. sección 1.5 en cap. 11).

4.3. Acilación con ácidos grasos y prenilación La adición de un ácido graso a una proteína puede influir en la asociación de esta proteína con una membrana o con otra proteína y, por ello, a menudo es importante en la transducción de señales. La acilación grasa del grupo –SH de la cisteína es reversible, mientras que la acilación grasa del grupo –NH3+ de un aminoácido N-terminal es irreversible. Una proteína acilada con un único ácido graso tiene mayor afinidad por las membranas, aunque reside en una membrana pocos minutos. Generalmente es necesaria una segunda interacción en forma de adición de un ácido graso adicional, un grupo prenilo (v. más adelante), aminoácidos con carga positiva o aminoácidos hidrófobos para aumentar el tiempo de residencia en las membranas hasta una escala temporal de varias horas.

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La palmitoilación, la adición de un ácido graso de 16 átomos de carbono, se produce principalmente en el grupo –SH de la cadena lateral de la cisteína, y se forma un enlace tioéster que se puede volver a escindir. La adición de palmitato por más de 20 palmitoil transferasas diferentes se produce principalmente en el aparato de Golgi, mientras que la eliminación del palmitato por acilproteína tioesterasas tiene lugar en toda la célula, lo que afecta a la asociación con la membrana y el tránsito entre membranas. Varias palmitoil transferasas del RE y el aparato de Golgi, además de varias acilproteína tioesterasas de la membrana plasmática, pueden catalizar la adición y la eliminación de palmitato a centenares de proteínas diferentes. La miristoilación, la adición de un ácido graso de 14 átomos de carbono, tiene lugar principalmente en la Gly N-terminal y, por lo tanto, es irreversible. Mientras que casi todas las proteínas recién sintetizadas contienen una metionina N-terminal, una metionina aminopeptidasa habitualmente elimina este residuo, de manera que la Gly en segunda posición puede pasar a ser ahora el aminoácido N-terminal. Debido a la especificidad de sustrato de las miristoíl-CoA:proteína N-miristoíl transferasas, solo se miristoílan algunas de las proteínas que tienen una Gly N-terminal. Durante la apoptosis, las caspasas (que son proteasas) escinden proteínas y de esta manera generan un fragmento que a menudo contiene un residuo de Gly N-terminal, que entonces se puede miristoilar. En la cara citosólica del RE, las proteínas se pueden prenilar irreversiblemente con farnesil pirofosfato o geranilgeranil pirofosfato. La síntesis del farnesil pirofosfato y el geranilgeranil fosfato se muestra en la figura 29.4. Los lugares de unión del prenilo se muestran en la figura 11.9. La prenilación tiene lugar en la cadena lateral de un residuo de cisteína en una secuencia de consenso próxima al extremo C-terminal de una proteína. La secuencia de aminoácidos particular determina si se produce farnesilación o geranilgeranilación. Algunas proteínas tienen una secuencia de consenso que especifica la geranilgeranilación sobre dos cadenas laterales de cisteína muy próximas entre sí. Después de la prenilación se eliminan los aminoácidos del extremo C-terminal, de modo que el residuo de cisteína prenilado forma el nuevo extremo C-terminal. Después, este extremo C-terminal es metilado, lo que hace que sea menos hidrófilo. La prenilación hace que una proteína sea más hidrófoba, aunque para tener una asociación estable con una membrana una proteína prenilada también debe adquirir un anclaje de ácido graso (v. más arriba) o contener una serie de aminoácidos con carga positiva que se unan a la superficie con carga negativa de una membrana que contenga fosfolípidos. La prenilación favorece una interacción de las proteínas con una membrana, como ocurre con la vía de transducción de señales de la proteína Ras en la vía de la proteína cinasa activada por mitógenos (v. cap. 33).

4.4. Fosforilación, sulfación y nitrosilación La fosforilación de las proteínas, la adición de un grupo fosfato a la cadena

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lateral de un residuo de serina, treonina o tirosina, es un método habitual para regular la función de las proteínas. Los seres humanos tienen más de 500 cinasas que catalizan la fosforilación y bastante más de 100 fosfatasas que desfosforilan las proteínas. Para la sulfación, la proteína-tirosina sulfotransferasa de la red trans-Golgi (TGN) utiliza 3′-fosfoadenosina-5′-fosfosulfato (PAPS; se puede ver su síntesis en la fig. 36.16) para sulfatar un residuo de tirosina en algunas proteínas segregadas y algunas proteínas transmembranarias. La S-nitrosilación de los residuos de cisteína de las proteínas por el óxido nítrico (NO) da lugar a SNO-proteínas (proteínas S-nitrosiladas). El NO se forma por la acción de NO sintasas y sirve como molécula de transducción de señales. La nitrosilación se puede revertir con glutatión reducido (v. fig. 21.5), de modo que se restaura el grupo –SH de la cisteína original.

4.5. Ubicuitinación y SUMOilación La ubicuitinación, la conjugación de una proteína con ubicuitina, un polipéptido de 76 aminoácidos, es reversible, se produce de múltiples maneras y tiene distintas funciones. Los seres humanos tienen más de 100 desubicuitinasas que pueden eliminar la ubicuitina de las proteínas ubicuitinadas. La monoubicuitinación es importante en la transducción de señales, como ocurre en la coordinación de la reparación del ADN o el silenciado de la expresión génica mediante la modificación de histonas. La poliubicuitinación a través del residuo Lys-48 de la ubicuitina es una señal para la degradación de una proteína en los proteosomas (v. fig. 35.1 y sección 1.2 en cap. 35). Las E3 ubicuitina-proteína ligasas (de las que hay más de 600) tienen una función crucial en la unión a proteínas y en el inicio de la ubicuitinación. Las proteínas con plegamiento anómalo se pueden poliubicuitinar porque tienen una hidrofobicidad excesiva o una secuencia que normalmente está oculta, pero que se reconoce como una señal para la degradación. La parkina es una enzima E3 que tiene una función importante en el control de la calidad de las proteínas en las mitocondrias, así como en la eliminación de mitocondrias mediante autofagia. La parkina mutante da lugar a una forma de enfermedad de Parkinson hereditaria (v. sección 8.5 en cap. 9). La conjugación de las proteínas con proteínas modificadoras pequeñas similares a ubicuitina (SUMO, small ubiquitin-like modifier) participa en la transducción de señales (pero no en la degradación de las proteínas). Los seres humanos sintetizan tres (posiblemente cuatro) proteínas SUMO importantes desde el punto de vista fisiológico; con sus ∼100 aminoácidos son ligeramente mayores que la ubicuitina. El conjunto de actividades enzimáticas necesarias para la SUMOilación es similar al conjunto necesario para la ubicuitinación. Sin embargo, en la selección de las enzimas para la SUMOilación participan muchas menos enzimas que para la ubicuitinación, en parte porque la SUMOilación se produce en las cadenas laterales de lisina

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de una secuencia de consenso. Las SUMO participan en la organización de la cromatina, la transcripción, la reparación del ADN y la producción de ribosomas. La SUMOilación puede evitar la formación de dímeros o multímeros mediante impedimento estérico, o puede favorecer la formación de complejos, tarea en la que habitualmente colaboran proteínas que contienen un motivo que interactúa con SUMO. Hay muchas hidrolasas específicas de SUMO que pueden deSUMOilar una proteína.

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5. Distribución de las proteínas y control de calidad Aproximadamente un tercio de las proteínas se traducen en el interior del RE y acaban en la membrana o la luz del RE. Las proteínas chaperonas reconocen las proteínas con un plegamiento anómalo, favorecen que se vuelvan a plegar y guían las proteínas defectuosas hacia su degradación. Las proteínas son transportadas del RE al aparato de Golgi en vesículas recubiertas. En el extremo trans del aparato de Golgi se clasifican las proteínas según su destino, que puede corresponder a los lisosomas, vesículas secretoras o la membrana plasmática. En general, las vesículas recubiertas con clatrina, proteína de la cubierta I (COPI) o proteína de la cubierta II (COPII) transportan proteínas (y lípidos) entre los distintos compartimentos subcelulares (fig. 7.9). Las proteínas de revestimiento, junto con proteínas adaptadoras de transporte vesicular, se unen a la cara citosólica de una membrana, la incurvan, se unen al contenido que deben transportar y dan lugar a una vesícula (fig. 7.10). Después de desprenderse por gemación, la vesícula ya no está recubierta, es decir, las proteínas de la cubierta y las proteínas adaptadoras de transporte vesicular se eliminan (se reutilizan). Dependiendo de las proteínas adaptadoras de transporte vesicular particulares de la superficie de las vesículas (o de las proteínas citosólicas que se unen a las proteínas adaptadoras de transporte vesicular), las vesículas no recubiertas se fusionan con la membrana diana con ayuda de los complejos SNARE (v. fig. 9.7).

FIG. 7.9

Transporte de proteínas entre los compartimentos intracelulares por medio de vesículas recubiertas. COP, proteína de la cubierta; RE, retículo endoplasmático.

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FIG. 7.10 Principio básico de la formación de vesículas y la distribución de las proteínas en el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi.

En el RE, las proteínas plegadas y recién sintetizadas entran en vesículas recubiertas por gemación en puntos de salida del RE específicos. La mayor parte de las proteínas salen del RE en vesículas recubiertas por COPII y entran en el aparato de Golgi en la cara cis, lugar en el que empiezan su migración a través del aparato de Golgi. La distribución de las proteínas tiene lugar en la TGN. Aproximadamente un tercio de todas las proteínas recién sintetizadas pasa por la TGN. En el lado citosólico de la TGN, proteínas adaptadoras de transporte vesicular reconocen las secuencias de aminoácidos de las proteínas transmembranarias. Estas proteínas adaptadoras de transporte vesicular también reconocen receptores de las sustancias transportadas, que son proteínas que a su vez se unen a proteínas solubles del interior de la TGN. En la TGN, las proteínas se pueden distribuir para que acaben en endosomas, lisosomas, gránulos secretores o la membrana plasmática (en las células epiteliales polarizadas, algunas proteínas se pueden distribuir de tal manera que acaben selectivamente en la membrana plasmática apical o basolateral). Las proteínas adaptadoras de transporte vesicular se unen a proteínas transmembranarias que contienen una secuencia localizadora coincidente. En su destino, las vesículas se fusionan con la nueva membrana y vacían su contenido soluble en el compartimento diana. Las proteínas adaptadoras de transporte vesicular también se pueden unir a proteínas receptoras de las sustancias transportadas. Estas a su vez se unen a las sustancias solubles que contiene la vesícula, como enzimas marcadas con manosa-6-fosfato destinadas a dirigirse a los lisosomas. En el RE, la mayor parte de las hidrolasas nacientes destinadas a los lisosomas se

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conjugan con un glucano de 14 residuos. En el aparato de Golgi, algunos residuos de manosa del glucano de 14 residuos se fosforilan para formar manosa-6-fosfato (esta enzima particular está ausente en la enfermedad de células I, que es muy infrecuente). La «enzima descubridora» (Nacetilglucosamina-1-fosfodiéster α-N-acetilglucosaminidasa) elimina los residuos de azúcar terminales para exponer la manosa-6-fosfato. En la membrana de la TGN, el receptor de manosa-6-fosfato, un receptor del contenido de las vesículas, se une a una enzima destinada a los lisosomas en virtud de su manosa-6-fosfato. En la cara citosólica de la membrana de la TGN, un adaptador de transporte vesicular se une a este receptor de manosa6-fosfato, lo que da lugar al transporte de la enzima a los lisosomas. El control de calidad postraduccional tiene lugar a varios niveles. En el RE, principal localización del plegado de las proteínas, las chaperonas son los principales detectores de plegamiento anómalo de las proteínas y tienen como función dirigir las proteínas a ser plegadas de nuevo o a ser degradadas. Para la degradación, las proteínas deben salir al citosol. Una vez allí, los monómeros de proteínas se pueden conjugar con ubicuitina y son degradados dentro de los proteosomas (v. fig. 35.1 y sección 1.2 en cap. 35), o pueden ser reconocidos por una chaperona por la presencia del motivo KFERQ (la secuencia Lys-Phe-Glu-Arg-Gln, que está presente en el ∼30% de todas las proteínas del citosol) y enviados a un lisosoma para su degradación. Los agregados de proteínas presentes en el citosol se recogen en un lugar centralizado y pueden entrar en macroautofagia, proceso mediante el cual los agregados son recubiertos por un autofagosoma que después se fusiona con un lisosoma para la degradación de las proteínas (la macroautofagia también recubre orgánulos defectuosos). Las proteínas con plegamiento anómalo, dañadas o defectuosas en el aparato de Golgi y en la membrana plasmática se envían preferentemente a los lisosomas para su degradación.

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Resumen ■ Los ARNt pueden leer múltiples codones gracias al emparejamiento de bases oscilante en la tercera posición de un codón. ■ Las mutaciones silentes modifican el codón, pero no el residuo de aminoácido; las mutaciones sin sentido o finalizadoras crean un codón finalizador, y las mutaciones de sentido equivocado codifican un aminoácido diferente. ■ Las mutaciones por desplazamiento del marco de lectura modifican el marco de lectura de parte de un ARNm. ■ El codón de inicio más frecuente es AUG en un contexto de secuencia adecuado. AUG codifica Met, que se elimina poco después de la síntesis de la proteína. ■ Durante la primera tanda de traducción, los ARNm con codones finalizadores prematuros son destruidos mediante degradación mediada por mutaciones finalizadoras (NMD). ■ La traducción en las mitocondrias difiere de la traducción en el citosol en cuanto a la composición de los ribosomas, los ARNt y el código genético. ■ Hay más de 500 ARNt codificados en el ADN del núcleo. Durante el procesado, los ARNt se prolongan con la secuencia CCA, y se modifican muchos nucleótidos. Las aminoacil-ARNt sintetasas cargan estos ARNt con su correspondiente aminoácido. ■ El ácido seudomónico (mupirocina), que se utiliza para tratar infecciones por Staphylococcus aureus resistente a meticilina, inhibe la isoleucil-ARNt sintetasa bacteriana. ■ Los miARN se unen a los ARNm y así alteran la traducción directamente o inducen la degradación del ARNm. ■ El estrés, las infecciones y la privación de nutrientes inhiben la traducción y pueden llevar al uso de codones de inicio alternativos. ■ Los aminoglucósidos, el cloranfenicol y los macrólidos se utilizan en la práctica clínica para alterar la traducción en las bacterias. ■ Las proteínas destinadas al citosol, el núcleo, las mitocondrias o los peroxisomas son sintetizadas por ribosomas en el citosol. Si es necesario, estas proteínas contienen secuencias localizadas específicas de orgánulo. ■ Las proteínas destinadas al retículo endoplasmático (RE), el aparato de Golgi, las vesículas secretoras, la membrana plasmática o los lisosomas tienen una secuencia señal. Las partículas de reconocimiento de señales (SRP) reconocen la secuencia señal de una proteína naciente, se unen al receptor de SRP y montan el ribosoma sobre el translocón para mover la cadena peptídica en crecimiento hacia el RE.

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■ En el RE, algunas proteínas nacientes son glucosiladas con un glucano de 14 residuos en el grupo amino de la cadena lateral de una asparagina. Posteriormente, en el aparato de Golgi el glucano suele sufrir grandes modificaciones. El aparato de Golgi también puede glucosilar proteínas en los residuos de serina y treonina. Los trastornos congénitos de la glucosilación (CDG) son una clase de trastornos que se pueden deber a falta de adición de un glucano en el RE, o a procesado defectuoso en el aparato de Golgi. ■ Las chaperonas pueden ayudar al plegamiento de las proteínas, unirse a proteínas agregadas, desplegar y volver a plegar proteínas con plegamiento anómalo, y dirigir las proteínas para su degradación en los proteosomas o los lisosomas. ■ La acilación con palmitato o miristato, o la prenilación con un grupo farnesilo o geranilgeranilo, incrementa la probabilidad de que una proteína resida en la membrana. La asociación a largo plazo con una membrana necesita dos o más modificaciones de este tipo, o secuencias adicionales de aminoácidos con carga positiva o hidrófobos. ■ La ubicuitinación de las proteínas puede llevar a su degradación o puede ser importante en diversos procesos, como la reparación del ADN y la transducción de señales. La SUMOilación participa en la transducción de señales, muchas veces creando un impedimento estérico o induciendo la unión a proteínas que contienen motivos de interacción con SUMO. ■ Las vesículas recubiertas transportan proteínas entre el retículo endoplasmático, el aparato de Golgi, la membrana plasmática y los lisosomas.

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Lecturas recomendadas ■ Barone R, Fiumara A, Jaeken J. Congenital disorders of glycosylation with emphasis on cerebellar involvement. Semin Neurol. 2014;34:357–366. ■ Jonas S, Izaurralde E. Towards a molecular understanding of microRNAmediated gene silencing. Nat Rev Genet. 2015;16:421–433. ■ Khatter H, Myasnikov AG, Natchiar SK, Klaholz BP. Structure of the human 80S ribosome. Nature. 2015;520:640–645. ■ Miller JN, Pearce DA. Nonsense-mediated decay in genetic disease: friend or foe? Mutat Res Rev Mutat Res. 2014;762:52–64. ■ Neupert W. A Perspective on transport of proteins into mitochondria: a myriad of open questions. J Mol Biol. 2015;427:1135–1158. ■ Ott M, Amunts A, Brown A. Organization and regulation of mitochondrial protein synthesis. Annu Rev Biochem. 2016;85:77–101. ■ Palsuledesai CC, Distefano MD. Protein prenylation: enzymes, therapeutics, and biotechnology applications. ACS Chem Biol. 2015;10:51–62. ■ Stroynowska-Czerwinska A, Fiszer A, Krzyzosiak WJ. The panorama of miRNA-mediated mechanisms in mammalian cells. Cell Mol Life Sci. 2014;71:2253–2270. ■ Torres AG, Batlle E, Ribas de Pouplana L. Role of tRNA modifications in human diseases. Trends Mol Med. 2014;20:306–314.

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CAPÍTULO 8

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Ciclo celular y cáncer Sinopsis ■ La actividad de las cinasas dependientes de ciclinas (CDK) es un regulador fundamental del ciclo celular. Las ciclinas incrementan la actividad de las CDK, mientras que las proteínas inhibidoras de las CDK la reducen. ■ Desde un estado quiescente, las células entran en el ciclo celular en respuesta a factores de crecimiento. La estimulación por factores de crecimiento activa las CDK, que a su vez inhiben la actividad de una proteína denominada proteína del retinoblastoma (RB). RB ya no se une a los factores de transcripción E2F. Los factores E2F libres alteran la expresión de las proteínas y favorecen la progresión a lo largo del ciclo celular. ■ Cuando hay daños en el ADN, la vía de p53 detiene el ciclo celular antes de que se replique el ADN. ■ En las células tumorales, la proteína RB, que impide la progresión del ciclo celular en células normales, y la proteína p53, que detiene el ciclo celular en respuesta al daño del ADN, frecuentemente son no funcionales. ■ La vía de WNT/β-catenina participa en el desarrollo y activa la transcripción de algunos genes, como el gen de la ciclina D y el de MYC, un factor de transcripción. En los tumores es frecuente que esta vía esté excesivamente activa. ■ A lo largo del tiempo, las células adquieren mutaciones. Una pequeña fracción de estas mutaciones es tumorígena. ■ La edad avanzada, un antecedente prolongado de tabaquismo, la obesidad y un consumo excesivo de alcohol son importantes factores de riesgo de cáncer. ■ Los genes que dirigen la formación de tumores se dividen en oncogenes y genes supresores de tumores. Un único alelo de un oncogén es suficiente para iniciar la tumorigenia, aunque los dos alelos de un gen supresor tumoral deben ser no funcionales para permitir la tumorigenia. Una célula tumoral típica contiene un oncogén y ha perdido la función de varios supresores de tumores. ■ Los pacientes con un síndrome de cáncer hereditario tienen mayor riesgo de neoplasias a una edad anormalmente temprana. Los síndromes de cáncer hereditarios habitualmente se deben a heterocigosidad para un alelo patógeno de un supresor de tumor.

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Algunas células somáticas adquieren posteriormente una alteración genética que anula la función del alelo restante, previamente normal. ■ Aproximadamente la mitad de los casos de síndrome de cáncer de mama y ovario familiar se debe a que se hereda una mutación del gen BRCA, que codifica una proteína que participa en la reparación del ADN. De manera similar, aproximadamente la mitad de los casos de melanoma familiar se debe a una mutación hereditaria del gen CDKN2A, que codifica un inhibidor del ciclo celular. La mayor parte de los casos de cáncer de colon hereditario se debe a síndrome de Lynch, que está causado por una alteración en la reparación de los errores de emparejamiento del ADN. Una pequeña fracción de los casos de cáncer de colon hereditario se debe a poliposis adenomatosa familiar (PAF), que está causada por una mutación del gen APC. ■ El tratamiento farmacológico del cáncer metastásico a menudo incluye fármacos que inducen enlaces cruzados en el ADN, además de fármacos que inhiben la síntesis de desoxitimidina monofosfato, las topoisomerasas o la reorganización de los microtúbulos antes de la división celular. ■ Para el tratamiento de determinadas formas de cáncer de mama, de pulmón y colorrectal y de melanoma hay varios inhibidores de cinasas que participan en vías de transducción de señales promotoras del crecimiento. ■ A los pacientes con cáncer de próstata, generalmente se les administra terapia de privación androgénica, independientemente de la dotación genética de las células tumorales. ■ Las células tumorales consumen mucha más glucosa que las células normales. Esto posibilita la localización de las metástasis después de infundir a un paciente fluorodesoxiglucosa radiactiva.

Objetivos de aprendizaje Para dominar este tema, debería ser capaz de hacer lo siguiente: ■ Comparar y contrastar las vías de RB y p53. ■ Explicar cómo el daño del ADN en la fase G1 normalmente produce detención del ciclo celular y posiblemente apoptosis. ■ Comparar y contrastar una oncoproteína y un supresor de tumores. ■ Describir la dotación genética de un tumor típico. ■ Describir las opciones de estilo de vida que pueden ayudar a los pacientes a reducir al mínimo el riesgo de cáncer. ■ Comparar y contrastar las principales causas genéticas del síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario, la PAF, el síndrome de Lynch y el melanoma familiar.

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■ Utilizar la anamnesis del paciente, los hallazgos clínicos y las pruebas de laboratorio para determinar si un paciente con cáncer colorrectal tiene cáncer esporádico, PAF o síndrome de Lynch. ■ Ante una alteración determinada en una vía de transducción de señales que favorece el crecimiento en un cáncer de mama, pulmón o colorrectal o en un melanoma, enumerar los fármacos que actúan sobre estas vías de transducción de señales y que se podrían utilizar para el tratamiento.

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1. El ciclo celular y su regulación El ciclo celular está formado por las fases G1, S (síntesis de ADN), G2 y M (mitosis). La activación por ciclinas de las cinasas dependientes de ciclinas (CDK) es esencial para que las células avancen por el ciclo celular. Cuando los factores de crecimiento estimulan las células quiescentes para que entren en la fase G1, las CDK activadas por ciclinas fosforilan la proteína del retinoblastoma (RB), que entonces deja de estar unida a los factores de transcripción E2F. Los E2F alteran la transcripción en las células para adaptarse a las necesidades del ciclo celular (p. ej., las necesidades de replicación del ADN). Si la proteína p53 recibe información sobre los daños del ADN, impide la entrada de la célula en la fase S e incluso puede inducir la apoptosis (autodestrucción de la célula). En la apoptosis, el ADN y muchas proteínas celulares se degradan de una manera regulada.

1.1. Ciclo celular y vía del retinoblastoma El ciclo celular se divide habitualmente en las siguientes fases: G0 (quiescencia), G1 (intervalo 1), S (síntesis de ADN), G2 (intervalo 2) y M (mitosis). En los adultos, la mayor parte de las células están en un estado quiescente (fig. 8.1).

FIG. 8.1

El ciclo celular y sus actividades cinasa específicas de fase.

Durante la fase G0, RB se une a los factores de transcripción E2F (fig. 8.2). Los E2F se unen a elementos promotores en sentido 5′ respecto a los genes (v. cap. 6). La unión de los E2F a RB impide la transcripción de los genes, cuyos

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productos intervienen en la proliferación celular.

FIG. 8.2 La fosforilación de la proteína del retinoblastoma (RB) por cinasas dependientes de ciclinas (CDK) libera el factor de transcripción E2F. MEC, matriz extracelular.

Para salir de la fase G0 y entrar en la fase G1, las células deben detectar una concentración suficientemente elevada de factores de crecimiento extracelulares (fig. 8.3); las células epiteliales también deben detectar la adherencia a la matriz extracelular (v. fig. 8.2). Son ejemplos de factores de crecimiento la insulina, el factor de crecimiento 1 similar a la insulina, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de los fibroblastos, los factores de crecimiento transformantes α y β (v. cap. 13) y la eritropoyetina (v. sección 1.3 en cap. 16). Los receptores de estos factores de

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crecimiento envían sus señales al citosol y al núcleo de las células (v. fig. 8.3). Las integrinas son proteínas de membrana que participan en la unión de los filamentos de actina y los filamentos intermedios (parte del citoesqueleto) del interior de las células a la matriz extracelular. Las integrinas pueden establecer esta unión en respuesta a señales intracelulares y también pueden indicar al interior de una célula que se ha producido la unión a la matriz extracelular.

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FIG. 8.3 Vías de transducción de señales de los factores de crecimiento. IGF-1, factor de crecimiento similar a la insulina 1; EGF, factor de crecimiento

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epidérmico; FGF, factor de crecimiento de los fibroblastos; NGF, factor de crecimiento nervioso.

Los receptores de factores de crecimiento que son tirosina cinasas transmiten las señales por las vías de PI3K/AKT/mTOR y RAS/RAF/ERK (vía de la MAPK). En la vía de PI3K/AKT/mTOR, el fosfatidilinositol 3,4,5trisfosfato (PIP3) es un fosfolípido de la membrana plasmática que activa la cinasa AKT. La fosfatasa PTEN desfosforila PIP3 a PIP2 y de esta manera inhibe la transducción de señales en la vía de PI3K/AKT/mTOR. La pérdida adquirida de uno de los dos alelos de PTEN se ve con frecuencia en tumores esporádicos, y la pérdida hereditaria de un alelo de PTEN da lugar al síndrome de Cowden, un síndrome de cáncer hereditario asociado a mayor probabilidad de neoplasias de glándula tiroides, mama, endometrio, riñones, colon y recto. La proteína cinasa activada por adenosina monofosfato (AMPK) fosforila y así inhibe a mTORC1 cuando la producción de energía está reducida (v. fig. 8.3). LKB1 (codificada por el gen STK11) es una proteína cinasa que activa a AMPK. El síndrome de Peutz-Jeghers se debe en la mayoría de las ocasiones a mutaciones con pérdida de función de STK11, el gen que codifica LKB1 (v. fig. 8.3). Las personas afectadas tienen mayor riesgo de diversos tumores, por ejemplo, del sistema gastrointestinal y de mama. La progresión por el ciclo celular es favorecida por las CDK, que a su vez son activadas por las ciclinas (v. figs. 8.1 y 8.2). Las ciclinas están presentes solo durante algunas partes del ciclo, mientras que la cantidad de proteína CDK es mucho menos variable. Las principales CDK son CDK1, CDK2, CDK4 y CDK6. Las principales ciclinas son A, B, D y E. Es frecuente que las ciclinas se sobreexpresen en las células tumorales. Los estímulos generados por los factores de crecimiento y la adhesión celular llevan a una mayor producción de ciclina D, que activa CDK4 y CDK6 (v. figs. 8.1 a 8.3). A su vez, CDK4 y CDK6 fosforilan la proteína RB, que posteriormente libera los factores de transcripción E2F. Algunos E2F unidos a elementos promotores incrementan la transcripción, mientras que otros la reducen. Como consecuencia, se modifica el programa de transcripción de la célula para adaptarlo a las necesidades del ciclo celular. Los E2F incrementan la transcripción de los genes que codifican la CDK2, las ciclinas A y E, la dihidrofolato reductasa y la ribonucleótido reductasa (todas ellas necesarias para la fase S), además de la CDK1 y la ciclina B (necesarias para la mitosis). La CDK2 activada por la ciclina E incrementa aún más la fosforilación de RB. La dihidrofolato reductasa es necesaria para la síntesis de timidina trifosfato (v. fig. 37.6), y la ribonucleótido reductasa es necesaria para la reducción de los ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos (v. fig. 37.5), que son necesarios para la replicación del ADN (v. cap. 3). Las proteínas inhibidoras de CDK (CKI) se unen a las CDK y las inhiben. Las CKI inhiben la unión de las ciclinas a las CDK y también reducen la catálisis en los complejos ciclina/CDK preformados. Los inhibidores Ink4

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(inhibidores de CDK4) inhiben solamente a CDK4 y CDK6. La familia de Ink4 está formada por p15Ink4b, p16Ink4a, p18Ink4c y p19Ink4d (abreviados: p15, p16, p18 y p19; v. figs. 8.1 y 8.2). La vía de RB es importante para que las células entren en la fase G1; esta vía tiene una actividad excesiva en la mayor parte de las células tumorales (se analiza más adelante en este capítulo). Los fenómenos tumorígenos habituales incluyen sobreexpresión de la ciclina D, pérdida de la función de RB y pérdida de la función de p16Ink4a. Los niños que han heredado solo una copia funcional del gen RB1 desarrollan retinoblastoma, muchas veces bilateral, antes de los 2 años de edad. Estos niños tienen un riesgo del ∼30% de presentar cáncer óseo en la adolescencia o un sarcoma de partes blandas o un melanoma cutáneo a los ∼30 años de edad. Después de llegar al punto de restricción (v. fig. 8.1), una célula avanza por el ciclo independientemente de los factores de crecimiento. Esto se consigue mediante la fosforilación de RB, la liberación de E2F, el aumento de la cantidad de ciclina E inducido por E2F y la degradación del inhibidor de CDK p27Kip1 inducida por el complejo ciclina E/CDK2. Durante la fase G1, los complejos de origen de la replicación se unen a los orígenes de la replicación (v. fig. 3.3) del ADN.

1.2. La vía del supresor tumoral p53 El punto de control de la integridad del ADN depende principalmente de p53, una proteína que detecta las señales de daño del ADN (fig. 8.4).

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FIG. 8.4

Daño del ADN y vía de p53.

Si no hay daño del ADN, la enzima MDM2 ubicuitina p53, como consecuencia de lo cual p53 se degrada dentro de los proteosomas (la ubicuitinación y los proteosomas se describen en la sección 1.2 en cap. 35). Cuando hay daños del ADN, las proteína cinasas ATM y ATR fosforilan p53 y MDM2; esto lleva a un aumento de la concentración de p53 (v. fig. 8.4). Este actúa como factor de transcripción e incrementa la concentración de CKI p21. A su vez, p21 inhibe CDK4/6 y CDK2, lo que lleva a la detención del ciclo celular (v. también fig. 8.1). La detención del ciclo celular inducida por el daño del ADN es redundante porque ATM también activa la cinasa de punto de control 2 (CHK2), y ATR activa la cinasa de punto de control 1 (CHK1; v. también sección 5 en cap. 2). Estas cinasas de punto de control también

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detectan daños del ADN y posteriormente impiden la activación del complejo ciclina B/CDK1, que es necesario para la mitosis. Aparte del daño del ADN, los oncogenes también pueden incrementar la actividad de p53 (v. fig. 8.4). Las mutaciones oncógenas de los genes RAS, RAF o ERK incrementan la síntesis de p14ARF. A su vez, p14ARF secuestra MDM2 en el interior del nucléolo, lo que incrementa la supervivencia de p53. La detección del daño del ADN o de las agresiones oncógenas por p53, a la que seguiría la parada del ciclo celular, suele estar alterada en las neoplasias. La mayor parte de los tumores contienen mutaciones de p53, y la mayoría de estas mutaciones reduce la unión de p53 al ADN. Es decir, las mutaciones hacen imposible que p53 actúe como un factor de transcripción que produce ARNm para las proteínas que detienen el ciclo celular o favorecen la apoptosis. Las mutaciones tumorígenas que alteran la vía del supresor tumoral p53 se encuentran frecuentemente en los genes ATM, CDKN2A (que codifica p14ARF y p16Ink4a) y MDM2. El síndrome de Li-Fraumeni es un síndrome de cáncer hereditario causado por la heterocigosidad de un gen TP53 mutante, que codifica p53. En las neoplasias, el segundo alelo de TP53 está mutado o no es funcional por otros motivos. Todos los pacientes afectados presentan tumores antes de los 70 años de edad; el primer tumor generalmente se diagnostica a los ∼30 años en las mujeres y los ∼40 en los hombres. Los tumores pueden aparecer en diversos tejidos, como hueso, tejido hematopoyético, mama, encéfalo y glándulas suprarrenales. Hay varios puntos de control del ciclo celular: uno para el ADN intacto al final de G1, otro para asegurarse de que la replicación del ADN sea completa en G2 y otro para la alineación correcta de los cromosomas en la fase M. El punto de control de G1 depende de las vías de p53 y RB: p53 incrementa la transcripción de inhibidores de los complejos ciclina D/CDK4 y ciclina D/CDK6; se fosforila menos RB, y más RB se une a E2F; y E2F ya no queda libre para estimular la transcripción génica que favorecería la progresión en el ciclo celular. Se considera que el punto de restricción es un proceso diferente del punto de control de G1 (independencia de factores de crecimiento en lugar de integridad del ADN), aunque los dos puntos de control dependen uno del otro por la interrelación entre las vías de RB y p53.

1.3. La vía de WNT/β-catenina Las vías de transducción de señales de WNT intervienen en el desarrollo, el establecimiento de la polaridad celular y el mantenimiento de las células progenitoras. La vía de transducción de WNT se divide en transducción de señales canónica y no canónica, que actúan con y sin β-catenina, respectivamente. Aquí solo se presenta la vía canónica con β-catenina. Los seres humanos sintetizan 19 proteínas WNT diferentes, que son palmitoiladas (v. fig. 11.9 y sección 1.5 en cap. 11) y glucosiladas (v. figs. 7.7 y 7.8 y sección 4.2 en cap. 7). Después de que una célula segregue una

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proteína WNT, WNT actúa sobre la misma célula o sobre una célula próxima. Los seres humanos sintetizan 10 proteínas Frizzled diferentes, que son los receptores de WNT y también son receptores acoplados a proteínas G. Si no hay señal de WNT, la β-catenina libre es fosforilada y ubicuitinada por un complejo de proteínas que incluye la proteína de la poliposis adenomatosa del colon (APC); una vez ubicuitinada, APC es degradada dentro de los proteosomas (v. fig. 35.1 y sección 1.2 en cap. 35). Cuando hay una señal de WNT, la β-catenina ya no se fosforila, ni se ubicuitina ni se degrada. Por el contrario, la β-catenina se une a un factor de transcripción de la familia del factor de linfocitos T/factor potenciador linfoide (TCF/LEF) (es decir, TCF7, TCF7L1, TCF7L2 o LEF1), que después entra en el núcleo e incrementa la transcripción de determinados genes que codifican proteínas que favorecen la proliferación celular, como el gen de la ciclina D1. La β-catenina también interviene en la conexión entre los filamentos de actina de células vecinas mediante uniones adherentes (fig. 8.5). Los filamentos de actina forman parte del citoesqueleto y ayudan a determinar y mantener la forma de la célula. Las uniones adherentes están formadas por cadherinas ancladas a la membrana (en dos células diferentes) que se unen entre sí en presencia de Ca2+, además de β-catenina, α-catenina y EPLIN o vinculina, que conectan la cadherina a los filamentos de actina.

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FIG. 8.5

Vía de WNT/β-catenina.

Durante la fase G0, la β-catenina está principalmente en la membrana celular en las uniones adherentes, y su concentración en el citosol es muy baja porque es degradada en los proteosomas (v. fig. 8.5). Durante las fases S y G2, la concentración de β-catenina soluble aumenta; después, cuando las células entran en la fase G0 o G1, la concentración vuelve a disminuir. En muchos tumores, particularmente adenomas pancreáticos y carcinomas colorrectales, la transducción de señales de WNT es activa independientemente de la presencia de WNT. Esto se debe habitualmente a una alteración genética que lleva a la pérdida de la función de APC (y, por ello, a la supervivencia de β-catenina libre incluso en ausencia de una señal de WNT), aunque también puede ser secundario a la ausencia de cadherinas.

1.4. Función de MYC Los factores de transcripción MYC (MYC o c-MYC, N-MYC y L-MYC)

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regulan la transcripción del ∼15% de todos los genes, muchos de los cuales codifican proteínas que intervienen en el crecimiento celular o la progresión en el ciclo celular. Normalmente, las señales generadas por la vía de RAS/RAF/ERK (v. fig. 8.3) o la vía de WNT (v. fig. 8.5) incrementan la velocidad de transcripción de los genes MYC (fig. 8.6). A su vez, las proteínas MYC se asocian con el factor de transcripción MAX para unirse a elementos promotores de la caja E, que contienen la secuencia CANNTG (N, cualquier nucleótido).

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FIG. 8.6

Función de MYC en el ciclo celular.

MYC favorece la transcripción de los genes que codifican las CDK4, las ciclinas o enzimas de la biosíntesis de nucleótidos, aunque reprime la transcripción de los genes que codifican los inhibidores de CDK p21 y p27. En los tumores, la actividad excesiva de MYC se puede deber a translocación (unión de un promotor diferente al gen MYC), amplificación génica o mutación de uno de los genes MYC. Además, el aumento de la actividad de MYC puede deberse a un aumento de señales corriente arriba (upstream) de la vía de WNT (v. fig. 8.5) o de la vía de RAS/RAF/ERK (v. fig. 8.3). De entre las amplificaciones génicas, la amplificación de los genes

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MYCN y MYCL (que codifican N-MYC y L-MYC, respectivamente) es especialmente frecuente. Los tumores que sobreexpresan MYC generalmente son muy sensibles a la privación de nutrientes.

1.5. Apoptosis La apoptosis es un proceso de suicidio celular regulado que puede iniciarse por señales extra- o intracelulares. Las señales extracelulares para la apoptosis son particularmente importantes en el desarrollo y el funcionamiento del sistema inmunitario. Las señales intracelulares que inducen apoptosis derivan de la respuesta al daño del ADN, la hipoxia o el estrés oxidativo. La apoptosis es la consecuencia neta de la interrelación entre factores proapoptóticos y antiapoptóticos. La apoptosis es una importante defensa contra la formación de una neoplasia. Durante la apoptosis se activan las caspasas intracelulares, que degradan proteínas y activan la degradación del ADN. Las caspasas contienen un residuo de cisteína (C) en el sitio catalítico y escinden sustratos que contienen un residuo de aspartato (Asp). Los seres humanos expresan 11 caspasas diferentes, siempre en forma de precursores inactivos (es decir, zimógenos, proenzimas o procaspasas) que se activan mediante proteólisis. Las caspasas están organizadas en cascadas en las que una caspasa activa otra caspasa, lo que amplifica mucho la actividad enzimática inicial. De entre las caspasas, las caspasas iniciadoras (caspasas 2, 8, 9 y 10) son importantes en las fases iniciales de la vía de transducción de señales. Las caspasas efectoras (caspasas ejecutoras; caspasas 3 y 7) catalizan los pasos terminales y degradan varios centenares de proteínas diferentes que contienen una secuencia N-Asp-x-x-Asp, mediante la hidrólisis de la proteína después del segundo residuo de Asp. La apoptosis se puede dividir en una vía extrínseca que depende de receptores localizados en la membrana plasmática y una vía intrínseca que depende de las mitocondrias. Las vías intrínseca y extrínseca utilizan diferentes caspasas iniciadoras, aunque tienen caspasas efectoras comunes. La vía intrínseca depende de la permeabilización de la membrana mitocondrial externa y la liberación de citocromo C desde el espacio intermembranario de las mitocondrias. La permeabilización de la membrana mitocondrial externa depende, a su vez, del equilibrio entre proteínas proapoptóticas, como BAX, y proteínas antiapoptóticas, como BCL2. En una célula perfectamente sana, la molécula antiapoptótica BCL2 prevalece sobre la molécula proapoptótica BAX, en parte mediante la formación de un dímero BCL2-BAX inactivo. Cuando prevalecen las señales proapoptóticas (como se describe más adelante en este capítulo), las mitocondrias liberan citocromo C (en la fosforilación oxidativa, el citocromo C normalmente transporta electrones del complejo III al complejo IV; v. fig. 23.3 y sección 1.2 en cap. 33). Cuando hay roturas de la doble cadena de ADN se activa p53, que favorece la apoptosis por las vías extrínseca e intrínseca (v. figs. 8.4 y 8.7). En respuesta

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al daño del ADN, ATM, ATR, CHK1 y CHK2 incrementan la actividad de p53, que a su vez activa la vía extrínseca favoreciendo la transcripción del ligando de FAS y del receptor de FAS, lo que a su vez lleva a la activación de las caspasas iniciadoras (caspasas 8 o 10) y las caspasas efectoras (caspasas 3 o 7). Las caspasas efectoras no solo degradan las proteínas, sino que también activan una ADNasa que corta el ADN en las regiones conectoras entre nucleosomas, generándose fragmentos de ∼180 pares de bases. p53 activa la vía intrínseca de la apoptosis estimulando la transcripción del gen BAX y del gen BBC3, que codifica la proteína PUMA. PUMA neutraliza BCL2 y activa la molécula proapoptótica BAX. BAX pasa al interior de la membrana externa de la mitocondria y hace que las membranas sean permeables al citocromo C. La presencia de citocromo C en el citosol favorece la formación de un apoptosoma, la activación de una caspasa iniciadora y la activación de las caspasas efectoras (v. fig. 8.7).

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FIG. 8.7 Apoptosis. APAF, factor 1 activador de proteasa apoptótica; Asp, asparagina; Cit. c, citocromo C; DISC, complejo de señalización inductor de muerte.

La apoptosis lleva a la fragmentación de una célula en numerosas vesículas recubiertas por membrana que son fagocitadas por neutrófilos y macrófagos. En las neoplasias, las alteraciones genéticas y epigenéticas a menudo llevan a la pérdida de los factores proapoptóticos y al aumento de los factores antiapoptóticos para favorecer la supervivencia de la célula a pesar de tener un ADN anómalo. Estas alteraciones también hacen que las células tumorales sean resistentes a la apoptosis inducida por la quimioterapia.

1.6. Control de las fases S, G2 y M del ciclo celular Durante la fase S se replica el ADN, se degrada la ciclina D, y los complejos ciclina E/CDK2 y posteriormente ciclina A/CDK2 aportan la principal actividad de CDK (v. fig. 8.1). La sobreexpresión de las ciclinas E1 y E2 es tumorígena y se observa en tumores de útero y ovario. La familia de proteínas Cip/Kip inhibe a CDK2, además de otras CDK. La familia Cip/Kip incluye p21Cip1, p27Kip1 y p57Kip2 (que se indican como p21, p27 y p57). El daño del ADN detectado por p53 lleva a una mayor síntesis de p21Cip1 (v. fig. 8.4). La eliminación de un estímulo de un factor de crecimiento induce la síntesis de p27Kip1, que es responsable de inducir y mantener la quiescencia (G0; v. fig. 8.1). La principal CDK para la transición de G2 a la fase M es el complejo ciclina B/CDK1, que ya se forma durante la fase S, pero se mantiene inactivo por la fosforilación inhibidora por parte de las cinasas denominadas proteína cinasas 1 y 2 similares a WEE1, y por la translocación al citosol. Al final de la fase G2 una CDC25 fosfatasa activa la CDK1 al desfosforilarla, y el complejo ciclina B/CDK1 se desplaza al núcleo. Cuando hay daño del ADN, CHK1 fosforila e inhibe a CDC25, que a su vez mantiene inactiva la CDK1 e imposibilita la entrada en la fase M.

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2. Alteraciones genéticas en las células cancerosas Los tumores y las células normales contienen muchas mutaciones. Un número relativamente pequeño de mutaciones oncoiniciadoras de entre todas estas mutaciones es responsable de la tumorigenia. Un único alelo de un oncogén (que representa una ganancia de función) es suficiente para favorecer la tumorigenia, aunque habitualmente deben estar alterados los dos alelos de un supresor de tumor para perder la función supresora de tumor y favorecer la tumorigenia. Las células tumorales habitualmente contienen aproximadamente de dos a ocho mutaciones oncoiniciadoras, de las cuales una es un oncogén y el resto son supresores de tumores. La edad es un importante factor de riesgo de cáncer. El tabaquismo incrementa aún más el riesgo de cáncer mediante la formación de aductos mutágenos del ADN. La obesidad es un factor de riesgo de un número escaso de cánceres, fundamentalmente cáncer de endometrio. El aislamiento y el análisis de las células tumorales circulantes son prometedores para establecer el pronóstico y determinar el tratamiento óptimo.

2.1. Alteraciones genéticas que favorecen las neoplasias El cáncer es la consecuencia de múltiples alteraciones del genoma de las células somáticas. Este daño está causado por una reparación inadecuada o defectuosa de las lesiones del ADN y de los errores de replicación. La mayor parte de las mutaciones que se ven en los tumores son sustituciones de un solo nucleótido, y la mayoría son mutaciones de sentido equivocado. En los adultos, los tumores sólidos habitualmente contienen ∼50 mutaciones que alteran la secuencia de aminoácidos de las proteínas (cuando hay alteración de la reparación del ADN, los tumores muestran un número de mutaciones aún mayor). Algunas de las mutaciones con importancia clínica incrementan la proliferación, y otras inhiben la apoptosis. En una clasificación binaria sencilla, las mutaciones oncoiniciadoras son fundamentales para la aparición de neoplasias, mientras que las mutaciones secundarias tienen pocas consecuencias. Actualmente se conocen ∼150 mutaciones oncoiniciadoras. Un tumor típico contiene de dos a ocho mutaciones oncoiniciadoras. Para un determinado tipo de cáncer (p. ej., cáncer de colon), los tumores difieren mucho en las alteraciones genéticas que presentan. En comparación con las células no malignas, los tumores muchas veces muestran aneuploidía (es decir, un número de cromosomas no divisible por 23) y otras alteraciones cromosómicas, como deleciones parciales, translocaciones y amplificación génica. Es probable que la mayor parte de

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estas alteraciones cromosómicas sean benignas. Las oncoproteínas procedentes de oncogenes favorecen la formación de neoplasias. Las oncoproteínas pueden ser proteínas normales que se expresan en cantidades anormalmente altas por amplificación génica o por una translocación cromosómica que enlaza el gen con un promotor que lleva a una mayor velocidad de transcripción. Otra posibilidad es que las oncoproteínas sean proteínas mutantes codificadas por oncogenes que a su vez derivan de protooncogenes; por ejemplo, el gen del receptor de un factor de crecimiento (un protooncogén) puede estar mutado a un oncogén, de manera que el receptor mutante transmite señales incluso sin que esté presente el factor de crecimiento. Es suficiente una única copia de un oncogén para que sea tumorígeno. Los supresores de tumores actúan contra la tumorigenia. En las neoplasias se puede perder la función supresora de tumores por mutación o por efectos epigenéticos. Las mutaciones pueden causar una pérdida de función por mutaciones de sentido equivocado, pérdida de la heterocigosidad (v. sección 4.2 en cap. 2), truncado o ayuste aberrante. Por ejemplo, las mutaciones del gen TP53, que codifica p53, a menudo alteran la unión del ADN a p53. El silenciado epigenético de la expresión de los supresores de tumores puede deberse a metilación del ADN, modificación de las histonas o miARN (v. sección 3 en cap. 7). Las dianas habituales de la metilación de los promotores son los genes CDKN2A (que codifica los CKI p14 y p16), MLH1 (codifica una proteína para la reparación de los errores de emparejamiento del ADN) y BRCA1 (codifica una proteína de reparación por recombinación homóloga). La mayor parte de las ocasiones se debe perder la función de los dos alelos de un supresor tumoral para que se produzca tumorigenia. La función de los dos alelos se puede perder por diversos mecanismos diferentes. En ocasiones solo es necesario que esté mutado un alelo de un gen supresor de tumor para que aparezca un tumor porque el alelo mutante tiene un efecto negativo dominante o porque hay haploinsuficiencia cuando hay un solo alelo funcional. Los miARN oncógenos son miARN que degradan el ARNm de los supresores de tumores, y los miARN supresores de tumores son miARN que degradan el ARNm de los oncogenes. Como los miARN incrementan la degradación de múltiples ARNm, sus efectos pueden ser específicos de tejido y difíciles de predecir. Las mutaciones de los supresores de tumores, los protooncogenes o los oncogenes pueden ser mutaciones oncoiniciadoras. Los tumores habitualmente tienen solo aproximadamente una mutación de un oncogén, mientras que las otras de una a siete mutaciones oncoiniciadoras restantes corresponden a la pérdida de la función supresora de tumor. La mayor parte de las principales mutaciones causantes de cáncer afectan a la función de una de aproximadamente una docena de vías. Las vías que se afectan con más frecuencia en el cáncer son las de RB (v. fig. 8.2 y sección 1.1) y p53 (v. fig. 8.4 y sección 1.2).

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La función de RB se pierde en casi todos los tumores. RB controla la transición entre las fases G1/S (v. figs. 8.1 y 8.2). La función de RB se puede perder por mutaciones que anulan la interacción de RB con E2F (p. ej., mutaciones puntuales que generan una proteína truncada, deleción de un segmento de ADN que incluye el gen RB1), inhibición por una proteína procedente de un virus (p. ej., proteína E7 del virus del papiloma) o fosforilación inadecuada de RB por una actividad excesivamente elevada de CDK2, CDK4 o CDK6 (debido a sobreexpresión de la ciclina D o la ciclina E o pérdida de la actividad inhibidora de p16 o p17). La función de p53 también se pierde frecuentemente en los tumores. Cuando hay un daño del ADN, p53 detiene el ciclo celular en el punto de control del ciclo celular G1/S (v. figs. 8.1 y 8.4). La función de p53 se puede perder por una mutación en el dominio de unión al ADN, secuestro en el citosol, degradación por aumento de la actividad de MDM2, degradación inducida por la proteína E7 del virus del papiloma o pérdida del inhibidor de MDM2 p14ARF. Al reducirse la función de p53, también se reduce la apoptosis. Muchas veces está activada la vía de PI3K/AKT (v. fig. 8.3), en ocasiones por pérdida de la actividad de PTEN. La mayor parte de los fármacos antineoplásicos dirigidos comercializados actualmente son inhibidores. Algunos de estos inhibidores se utilizan para reducir la función de las oncoproteínas, como las proteína cinasas. En su mayor parte no se dispone de fármacos que remedien directamente la pérdida de función supresora de tumores. Sin embargo, la pérdida de la actividad supresora de tumores generalmente lleva a un aumento de la actividad de otra proteína en sentido distal en la misma vía, que en ocasiones se puede inhibir con un fármaco. Muchos síndromes de cáncer hereditarios se heredan con un patrón autosómico dominante y se deben a la herencia de solo una copia funcional de un alelo de un supresor de tumores. El patrón de herencia de cualquier enfermedad depende de la definición del trastorno. En los síndromes de cáncer hereditarios, la enfermedad se define como un inicio anormalmente temprano y una probabilidad anormalmente elevada de presentar una neoplasia determinada. Para que se forme una neoplasia, generalmente se debe perder la función de los dos alelos de un gen supresor tumoral. La aparición de una mutación inactivadora depende del tiempo. En una persona que solo tiene un alelo que perder mediante inactivación, el cáncer aparece antes que en una persona que tiene dos alelos que perder; de aquí el patrón de herencia dominante.

2.2. Efecto de la edad sobre la tumorigenia El riesgo de ser diagnosticado de cáncer aumenta mucho con la edad (fig. 8.8), probablemente porque las mutaciones se acumulan con el tiempo. De hecho, los tumores en niños generalmente contienen menos mutaciones

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que los de los ancianos. Además, incluso la piel envejecida normal contiene una fracción importante de mutaciones oncoiniciadoras tumorígenas. A los 85 años de edad, el ∼50% de las personas desarrollan cáncer. Se podría suponer que si una persona llega a tener una edad suficientemente avanzada morirá de cáncer, pero en realidad, según predicciones matemáticas, incluso una persona de 120 años de edad tiene una probabilidad de no morir por cáncer del ∼20%.

FIG. 8.8 La edad como importante factor de riesgo de cáncer. Tasas de incidencia en Estados Unidos 2009–2013, del programa Age-specific Surveillance, Epidemiology, and End Results (Vigilancia, epidemiología y resultados finales por edades; SEER Program). (Datos de Howlader N, Noone AM, Krapcho M, et al, eds. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2013, National Cancer Institute. Bethesda, MD: Disponible en http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013.)

Una gran parte del riesgo de cáncer dependiente de la edad se asocia al número de divisiones de las células progenitoras, posiblemente debido a los errores de replicación asociados. El cáncer es, por tanto, una consecuencia del azar, y las mutaciones adicionales debidas al tabaquismo, la exposición a la radiación ultravioleta (UV), el consumo excesivo de alcohol o la obesidad (v. el texto siguiente) incrementan aún más esta probabilidad. Los tumores que se cree que están favorecidos por mutágenos, como el cáncer de pulmón inducido por el tabaco y el melanoma inducido por la

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radiación UV, contienen un número especialmente elevado de mutaciones. Por ejemplo, los carcinomas pulmonares no microcíticos de los fumadores tienen ∼10 veces el número de mutaciones que se encuentran en los mismos tumores de los no fumadores. Aunque los signos clínicos de una neoplasia maligna aparecen en un espacio de tiempo corto, los tumores tardan varios años o décadas en desarrollarse.

2.3. Tabaquismo y cáncer El tabaco incrementa la probabilidad que tiene una persona de presentar cáncer de las cavidades oral y nasal, pulmón, esófago, páncreas, vejiga y otros órganos. En todo el mundo el ∼20% de todas las muertes por cáncer se atribuye a fumar tabaco. El humo de tabaco contiene unos 20 carcinógenos conocidos, que se pueden agrupar en hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH) y la nitrosamina 4-(metilnitrosamino)- 1-(3-piridil)-1-butanona. El PAH más estudiado es el benzo[a] pireno, que es muy carcinógeno (v. cap. 2). Los carcinógenos son modificados en el cuerpo, y después ejercen su efecto tóxico mediante la formación de aductos con el ADN, predominantemente en las bases G o A. La reparación de estos aductos se realiza mediante reparación por escisión de nucleótidos (REN; v. fig. 2.7 y sección 3 en cap. 2). Si los aductos escapan a una reparación adecuada del ADN, pueden llevar a una mutación permanente. Entre las muchas mutaciones permanentes, algunas llevan a la formación de un oncogén, y otras a la pérdida de la función de los supresores de tumores. El humo de una pipa de agua (shisha, hookah) es un importante riesgo para la salud porque emanan cantidades significativas de carcinógenos del carbón vegetal que se utiliza para calentar el tabaco, y estos carcinógenos se inhalan con el humo. Para una cantidad de nicotina consumida comparable, el humo de una pipa de agua contiene ∼10 veces más benzo[a]pireno que el humo de un cigarrillo. A pesar de que fumar incrementa mucho el riesgo de cáncer de pulmón de una persona, no más del ∼20% de los fumadores desarrollan un cáncer de pulmón. El tabaco para mascar contiene N-nitrosaminas que causan cáncer de la cavidad oral.

2.4. Obesidad, alcohol y cáncer La obesidad es un factor de riesgo específico de sexo que afecta al riesgo que tiene una persona de desarrollar determinadas neoplasias, especialmente de útero, vesícula biliar, riñones e hígado (fig. 8.9; el cálculo del índice de masa corporal [IMC] se explica en la sección 5.1 del cap. 39; un IMC >30 kg/m2 indica obesidad). Por el contrario, la incidencia de melanoma y cáncer de

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vejiga no depende mucho de la adiposidad.

FIG. 8.9 Riesgo relativo de cáncer en órganos seleccionados. Se analizaron los registros de ∼5 millones de personas del Reino Unido (el ∼9% de todos los habitantes) en el periodo 1987–2012. (Datos de Bhaskaran K, Douglas I, Forbes H, dos-Santos-Silva I, Leon DA, Smeeth L. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5⋅24 million UK adults. Lancet. 2014;384:755-765.)

La explicación más estudiada para el vínculo entre obesidad y cáncer corresponde al cáncer de endometrio. La principal diferencia entre una persona obesa y una delgada es la masa de tejido adiposo. El tejido adiposo convierte la androstenodiona circulante en estrona (v. fig. 31.5 y sección 2.4 en cap. 31), que es la principal fuente de estrógenos después de la menopausia. La elevada concentración de estrona inducida por la obesidad favorece el crecimiento de tumores dependientes de estrógenos. Otras explicaciones propuestas para el aumento del riesgo de cáncer inducido por la obesidad afirman que el aumento inducido por la obesidad de la concentración de insulina o de las hormonas liberadas por el tejido adiposo (p. ej., más leptina y menos adiponectina) favorece las vías de transducción de señales promotoras del crecimiento, como PI3K/AKT y RAS/RAF/ERK (v. fig. 8.3). El efecto del consumo de etanol (alcohol) solo (y combinado con tabaco) sobre el riesgo de cáncer de boca, faringe, laringe y esófago se describe en la

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sección 4.5 del capítulo 30. A partir de lo anterior es evidente que el asesoramiento de los pacientes sobre el tabaquismo, el IMC y el consumo de alcohol debe ser una parte integral de la asistencia sanitaria.

2.5. Células tumorales circulantes Las células tumorales circulantes (CTC) son células que se han desprendido de un tumor o de sus metástasis y han entrado en el torrente circulatorio. Las CTC tienen interés en relación con el pronóstico y la monitorización del tratamiento. Después de la extirpación de un tumor primario, las CTC son un indicador de la abundancia de células tumorales residuales. En el laboratorio, las CTC se enriquecen e identifican en base a la presencia o ausencia de determinadas proteínas de la superficie celular. Las CTC son muy infrecuentes. Una muestra de sangre que da un resultado positivo para CTC habitualmente contiene más de cuatro células por cada 7,5 ml de sangre en un tubo para la recogida de muestras sanguíneas. Hoy en día es posible analizar el ADN en una única CTC. Actualmente se pueden utilizar las CTC para establecer el pronóstico y elegir el tratamiento del cáncer de mama, próstata y colon.

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3. Ejemplos de neoplasias frecuentes Las mutaciones hereditarias de BRCA son una causa del síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario (CMOH). Los tratamientos dirigidos de uso más habitual en el cáncer de mama son los moduladores selectivos del receptor de estrógenos, los inhibidores de la aromatasa y la inhibición del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). Muchos tumores pulmonares expresan cinasas que pueden ser inhibidas con métodos farmacológicos. Los tumores de próstata son genéticamente muy variados y a menudo contienen una translocación que sitúa un promotor con un elemento de respuesta a andrógenos cerca de un factor de transcripción. En consecuencia, los pacientes con cáncer de próstata avanzado frecuentemente reciben terapia de privación androgénica. Los cánceres colorrectales esporádicos frecuentemente carecen de proteína APC funcional y, por ello, son similares a los tumores de los pacientes con poliposis adenomatosa familiar (PAF; causada por una pérdida monoalélica hereditaria de la función de APC). Otra posibilidad es que los cánceres colorrectales esporádicos carezcan de una vía funcional para la reparación de los errores de emparejamiento del ADN y, por ello, son similares a los tumores de los pacientes con síndrome de Lynch (causado por la pérdida hereditaria monoalélica de un gen para la reparación de errores de emparejamiento). El melanoma metastásico habitualmente se trata con inmunoterapia. El crecimiento de los tumores con resultado positivo para una mutación de RAF se puede bloquear transitoriamente con inhibidores específicos de cinasas. Aproximadamente la mitad de los casos de melanoma familiar se deben a mutaciones en un gen que codifica un inhibidor de la progresión del ciclo celular. Muchos de los detalles que conocemos sobre los cambios genéticos que aparecen en diversos tumores se basan en el secuenciado paralelo masivo (secuenciado de próxima generación; v. sección 5.2 en cap. 4). Este secuenciado actualmente se está introduciendo en la práctica clínica, fundamentalmente en forma de paneles génicos en cánceres seleccionados. Los principales desafíos en la actualidad son aprender a interpretar las implicaciones de las mutaciones observadas y determinar los tratamientos más eficaces. Los profesionales sanitarios deben conocer el significado y las limitaciones de las pruebas antiguas y actuales, particularmente cuando traten a pacientes que tengan un síndrome de cáncer hereditario. Actualmente es evidente que hay aproximadamente una docena de vías que de manera constante funcionan anormalmente en el cáncer (v. sección 2.1). Los pacientes que tienen una mutación hereditaria en una de estas vías habitualmente tienen mayor probabilidad de presentar tumores en múltiples órganos. Por lo tanto, un antecedente familiar de cáncer en un órgano puede deberse a diversos síndromes de cáncer hereditarios; en consecuencia, se debe estudiar a los familiares afectados para detectar mutaciones en múltiples vías.

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A modo de ejemplo, una paciente que parece tener síndrome de Lynch frecuentemente también cumple los criterios para realizar un estudio para detectar CMOH. Con una frecuencia cada vez mayor se utilizan paneles génicos y secuenciado paralelo masivo para detectar múltiples alteraciones genéticas (v. sección 6 en cap. 4). Actualmente, el tratamiento más eficaz del cáncer es la extirpación del tumor mediante cirugía. Sin embargo, frecuentemente hay metástasis en zonas que no se pueden tratar fácilmente con cirugía. Actualmente no hay métodos suficientes para detectar grupos pequeños de células precursoras antes de que den lugar a un cáncer. Sin embargo, se pueden detectar con éxito algunas enfermedades premalignas, como los pólipos adenomatosos del colon mediante colonoscopia y la displasia cervical mediante colposcopia.

3.1. Cáncer de mama Según su histología, los tumores de mama se dividen habitualmente en carcinomas ductales y carcinomas lobulillares (figs. 8.10 y 8.11), lo que implica que las células tumorales se originan en el epitelio de los conductos o los lobulillos. A veces hay carcinomas mixtos ductales y lobulillares. Además, los tumores se dividen en carcinomas in situ, cuyo crecimiento está limitado al epitelio de los conductos o lobulillos, y carcinomas invasivos (infiltrativos), que han crecido más allá de los confines de los conductos y lobulillos hacia el tejido conjuntivo de la mama. Aproximadamente el 25% de todos los tumores de mama son carcinomas ductales in situ; el ∼60%, carcinomas ductales invasivos; y el ∼5%, carcinomas lobulillares invasivos.

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FIG. 8.10

Estructura de la mama femenina.

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FIG. 8.11

Carcinoma ductal y lobulillar.

En Estados Unidos, el ∼12% de todas las mujeres llegará a tener un cáncer de mama invasivo. Aproximadamente el 90% de estas pacientes tiene cáncer de mama esporádico, mientras que el ∼10% tiene una mutación hereditaria asociada a mayor riesgo de cáncer. Las mutaciones de los genes BRCA1 y BRCA2 son los principales factores que contribuyen al síndrome de CMOH: son responsables del ∼50% de los casos. Las proteínas BRCA1 y BRCA2 intervienen en la reparación por recombinación homóloga de las roturas de la doble cadena (v. sección 4.2 en cap. 2). Otro ∼8% de los casos de CMOH se debe a mutaciones de otros genes, como PALB2, CHEK2 y los genes mutados que causan otros síndromes de cáncer hereditario conocidos, como TP53 (síndrome de Li-Fraumeni), PTEN (síndrome de Cowden), STK11 (síndrome de Peutz-Jeghers) y ATM. Aún están por descubrir muchas más causas genéticas de CMOH. En Estados Unidos, al menos 1 de cada 400 personas ha heredado una mutación patogénica de BRCA1 o BRCA2 (en judíos askenazíes la incidencia es de ∼1:40). En las mujeres con cáncer de mama, la prevalencia de una mutación heredable de BRCA es del ∼2%. A los 70 años de edad, una mujer que ha heredado una mutación de BRCA1 o BRCA2 tiene una probabilidad del ∼55% de presentar cáncer de mama y del ∼25% de presentar cáncer ovárico (las tasas de incidencia son algo mayores para las mutaciones de BRCA1 y menores para las de BRCA2). Desde el punto de vista clínico, la importancia del diagnóstico de un CMOH radica en el aumento de la vigilancia, el estudio de los familiares y los

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ajustes en el tratamiento. Las mutaciones más frecuentes en los tumores mamarios esporádicos determinadas mediante secuenciado paralelo masivo (v. sección 5.2 en cap. 4) están en los genes TP53 y PIK3CA. p53 se activa en respuesta al daño del ADN y después detiene el ciclo celular aumentando la expresión de p21 (v. fig. 8.4). El gen PIK3CA codifica la subunidad catalítica de la PI3K (v. fig. 8.3). Las mutaciones de PIK3CA generalmente llevan a un aumento de la actividad de la vía de PI3K/AKT/mTOR, que inhibe la apoptosis y favorece la síntesis proteica. Los tumores mamarios de las pacientes con un alelo de BRCA no funcional en la línea germinal generalmente tienen pérdida de función de BRCA por una alteración somática. El principal tratamiento del cáncer de mama es la extirpación quirúrgica de la lesión; dependiendo de la naturaleza del tumor, se añade radioterapia complementaria y terapia sistémica complementaria para destruir cualquier célula tumoral que pueda haber quedado. La radioterapia utiliza radiaciones ionizantes, que inducen roturas en una sola cadena o en la doble cadena (v. sección 4 en cap. 2). La terapia sistémica a menudo incluye un régimen con una antraciclina y ciclofosfamida, seguida por tratamiento con un taxano (se abrevia como régimen AC-T). Las antraciclinas son intercaladores del ADN, y el fármaco más utilizado es la doxorubicina, que también inhibe la topoisomerasa II (v. sección 5 en cap. 1). La ciclofosfamida es una mostaza nitrogenada que induce enlaces cruzados intra- e intercatenarios en el ADN (v. sección 4.2 en cap. 2). Los taxanos inhiben la degradación de los microtúbulos, que forman parte del citoesqueleto. Los microtúbulos sirven como trayectos para el transporte intracelular de sustancias, son degradados como preparación para la profase, se unen a los cinetocoros durante la prometafase y después sirven como raíles para las proteínas motoras que separan entre sí las cromátidas durante la anafase. En el tejido tumoral habitualmente se estudian los receptores de estrógenos (ER), receptores de progesterona (PR) y HER2, porque los resultados predicen la eficacia de las terapias dirigidas. Las funciones fisiológicas de los estrógenos y la progesterona se describen en la sección 2.4 del capítulo 31. HER2 forma un heterodímero con un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) estimulado por el factor de crecimiento epidérmico y después activa las vías de RAS/RAF/ERK y PI3K/AKT/mTOR (v. fig. 8.3). Si el tumor es positivo para ER y PR, la terapia hormonal suele incluir el uso de un modulador selectivo del receptor de estrógenos, como tamoxifeno; a veces se utiliza un inhibidor de la aromatasa (la aromatasa es necesaria para la síntesis de estrógenos; v. fig. 31.5 y sección 2.4 en cap. 31). Si el tumor es positivo para HER2, es frecuente el tratamiento con uno o dos anticuerpos monoclonales anti-HER2 diferentes (trastuzumab, pertuzumab) o con lapatinib, un inhibidor de la actividad tirosina cinasa de HER2 y EGFR. Los tumores negativos para ER, PR y HER2 se denominan negativos triples. En los ensayos clínicos tal vez la mitad de todas las pacientes que tienen

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una mutación de BRCA en la línea germinal y después presentan cáncer de mama se benefician del uso de un inhibidor de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP). La inhibición de la PARP altera la vía de reparación del ADN por escisión de bases (REB; v. sección 1 en cap. 2). Debido a la redundancia en las vías de reparación del ADN, las células con BRCA1 y BRCA2 funcionales sobreviven en presencia de inhibidores de la PARP. Sin embargo las células sin BRCA1 y BRCA2 funcionales sufren apoptosis cuando un inhibidor de la PARP inhibe la REB (a veces se considera que este hallazgo es un ejemplo de letalidad sintética).

3.2. Cáncer de pulmón El tabaquismo incrementa el riesgo de cáncer de pulmón de una persona en 15-30 veces. En el Reino Unido, a los 75 años el ∼13% de las personas que han fumado durante toda su vida muere por cáncer de pulmón. Los fumadores son el ∼90% de todos los pacientes con cáncer de pulmón. El abandono del tabaco (en comparación con seguir fumando) reduce a la mitad el riesgo de cáncer de pulmón inducido por el tabaco cada 10 años. Cuando no hay una mutación oncoiniciadora evidente sobre la que se pueda actuar con métodos farmacológicos, el cáncer de pulmón se trata con fármacos con platino y un inhibidor de la topoisomerasa. Tras este tratamiento a veces se administra radioterapia. Los tumores que contienen determinadas mutaciones oncoiniciadoras de tirosina cinasas se pueden tratar con inhibidores de tirosina cinasas. Así, los pacientes con una mutación oncoiniciadora de EGFR pueden recibir erlotinib o gefitinib (que inhiben reversiblemente la actividad tirosina cinasa del EGFR), o se les puede tratar con afatinib (que inhibe irreversiblemente las actividades tirosina cinasa de EGFR y HER2). Los pacientes con un oncogén de fusión de la cinasa del linfoma anaplásico (ALK, una tirosina cinasa de receptor) pueden ser tratados con los inhibidores de proteína cinasas crizotinib y ceritinib. El carcinoma broncógeno supone el ∼95% de todos los cánceres de pulmón y se subdivide como se señala a continuación. El carcinoma pulmonar microcítico (CPM, carcinoma de células en avena) constituye el ∼20% de todos los cánceres de pulmón y se relaciona principalmente con el tabaco (v. fig. 1.11). Los tumores microcíticos tienen una elevada tasa de mitosis y también son muy sensibles a la quimioterapia sistémica, aunque siguen teniendo la menor tasa de supervivencia a los 5 años de entre todos los pacientes con cáncer de pulmón. EL CPM habitualmente se trata con fármacos con platino, que generan aductos intra- e intercatenarios que son reparados mediante REN y reparación por recombinación homóloga, respectivamente (v. figs. 2.8 y el 2.10 y secciones 3 y 4.2 en cap. 2). El carcinoma pulmonar no microcítico (CPNM) constituye el ∼70% de todos los cánceres de pulmón, y se subdivide en los tres tipos siguientes:

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1. El carcinoma epidermoide (carcinoma escamocelular; fig. 8.12) supone el ∼35% de todos los cánceres de pulmón y se relaciona con el tabaco. Aproximadamente el 80% de los tumores contienen mutaciones de TP53; el ∼70% tienen deleciones, metilación del promotor o mutaciones del gen CDKN2A (que codifica los inhibidores de CDK p16Ink4a y p14Arf); el ∼50% contienen alteraciones de la vía de PI3K/AKT, y el ∼35% presentan alteraciones de la vía de RTK/RAS/RAF/ERK. 2. El adenocarcinoma (AC) constituye el ∼25% de todos los cánceres de pulmón y habitualmente está cerca de la periferia pulmonar (fig. 8.13). Aproximadamente el 80% de estos tumores aparece en fumadores, y el ∼20%, en no fumadores. El AC es la forma más frecuente de cáncer de pulmón en no fumadores. Los adenocarcinomas pulmonares en fumadores tienen aproximadamente 10 veces más mutaciones que en no fumadores. El AC es genéticamente muy diverso y es difícil de tratar con éxito. El tratamiento individualizado puede ser más eficaz que la quimioterapia estándar. El análisis genético de mutaciones patógenas fundamentales seleccionadas y el tratamiento específico de mutación constituyen en la actualidad el tratamiento estándar. Aproximadamente el 75% de los AC tienen alteraciones en la vía de RTK/RAS/RAF (por lo que los principales factores que contribuyen son las mutaciones de EGFR y KRAS); el ∼65%, una alteración en la vía de p53 (en casi todos los casos atribuible a mutaciones de TP53), y el ∼65%, una alteración en la regulación del ciclo celular (p. ej., por una alteración de CDKN2A). Una pequeña proporción de tumores contiene una translocación que genera un oncogén de fusión ALK (el tratamiento se puede ver en la discusión anterior). 3. El carcinoma anaplásico de células grandes (fig. 8.14) constituye el ∼10% de todos los cánceres de pulmón y habitualmente se relaciona con el tabaco. Tiene una tasa de supervivencia a los 5 años del ∼10%, que es la menor de entre todos los CPNM.

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FIG. 8.12

Carcinoma epidermoide pulmonar.

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FIG. 8.13

Adenocarcinoma pulmonar.

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FIG. 8.14

Carcinoma anaplásico de células grandes pulmonar.

3.3. Cáncer de próstata En Estados Unidos, el riesgo de cáncer de próstata a lo largo de toda la vida en hombres (fig. 8.15) es del ∼14%, ligeramente mayor que el riesgo de cáncer de mama a lo largo de toda la vida en mujeres.

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FIG. 8.15

Cáncer de próstata.

En el interior de la glándula prostática, el cáncer de próstata a menudo se desarrolla en varios focos diferentes, el mayor de los cuales se denomina tumor índice. El tamaño del tumor y el grado de Gleason derivado del estudio histológico determinan el pronóstico. Las principales alteraciones genéticas de los tumores prostáticos son translocaciones que sitúan un promotor regulado por andrógenos próximo al gen del factor de transcripción ERG o de otros miembros de esta familia. Un tumor prostático típico tiene ∼90 alteraciones cromosómicas. La dotación genética de estos tumores es muy variada y da lugar a numerosos subtipos. En comparación con otros tumores, los tumores prostáticos tienen relativamente pocas mutaciones puntuales. Aparte de la cirugía y la radioterapia, el tratamiento del cáncer de próstata avanzado suele incluir terapia de privación androgénica. La concentración de testosterona se puede reducir mucho mediante castración quirúrgica o química (v. sección 2.2 en cap. 31). También suelen utilizarse taxanos (inhibidores de la degradación de los microtúbulos; v. sección 3.1).

3.4. Cáncer colorrectal En Estados Unidos, el riesgo de cáncer colorrectal a lo largo de toda la vida es

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del ∼5%. Los carcinomas colorrectales se originan en pólipos adenomatosos que a su vez dan lugar a adenomas, que muestran cierta displasia y aumento de la proliferación. La colonoscopia con extirpación de los pólipos y adenomas puede reducir significativamente la incidencia de cáncer colorrectal. La mayor parte de los pacientes con cáncer colorrectal tienen la forma esporádica, aunque el ∼5% de todos los pacientes con cáncer colorrectal tienen los síndromes de cáncer hereditarios síndrome de Lynch, poliposis asociada a MUTYH (PAM) o PAF. Los pacientes con PAF tienen un alelo de APC no funcional en la línea germinal y han perdido la función del segundo alelo en las neoplasias. En Estados Unidos, la PAF afecta a ∼1 de cada 8.000 personas. De todos los pacientes con cáncer colorrectal, el ∼0,5% tienen PAF. Aproximadamente el 70% de las personas tienen un progenitor con PAF, y el ∼30% tienen PAF por una mutación de novo, a menudo en la línea germinal de un progenitor; sea como fuere, cada uno de los miembros de la descendencia de un paciente afectado tiene un riesgo de recibir el alelo de APC defectuoso del 50%. Casi todos los alelos de APC patógenos llevan al truncado de la proteína APC expresada. APC es un supresor tumoral que interviene en la degradación de la βcatenina (v. fig. 8.5, sección 1.3). Si no hay una señal de WNT, la β-catenina se degrada. En presencia de una señal de WNT, como durante el desarrollo, APC ya no degrada la β-catenina; la β-catenina se une entonces a factores de transcripción de la familia TCF/LEF, se dirige al núcleo y estimula la transcripción de determinados genes que contribuyen a la progresión por el ciclo celular, entre ellos MYC (v. fig. 8.6). Cuando la proteína mutante APC ya no puede guiar la degradación de la β-catenina, la célula se comporta como si estuviera presente una señal de WNT que favorece la proliferación celular. Los pacientes que tienen PAF han nacido con solo un alelo de APC funcional. La alteración somática del segundo alelo (el único alelo funcional) hace que aparezcan numerosos pólipos y, si no se extirpan, el cáncer colorrectal aparece antes que en los pacientes que tienen los dos alelos de APC funcionales. El tratamiento sistémico de los pólipos con el antiinflamatorio no esteroideo sulindaco reduce el número y el tamaño medios de los pólipos colorrectales. En los pacientes que tienen PAF es frecuente la extirpación profiláctica del colon, habitualmente en la tercera década de la vida. Sin colectomía los pacientes presentan de centenares a miles de adenomas en el colon, y su riesgo de cáncer colorrectal es próximo al 100% a los 40 años de edad (fig. 8.16). Dependiendo de la mutación específica del gen APC, la PAF se asocia también a pólipos en el tubo digestivo superior, tumores en el encéfalo (especialmente meduloblastoma), quistes epidermoides, tumores desmoides y osteomas (la mayor parte de las ocasiones en la cara).

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FIG. 8.16

Poliposis adenomatosa familiar del intestino grueso.

Aproximadamente el 85% de los tumores colorrectales esporádicos (fig. 8.17) han perdido la función de APC (igual que en la PAF). La mayor parte de los tumores colorrectales esporádicos tienen ∼60 mutaciones que afectan a la secuencia de aminoácidos de una proteína. La mayor parte de estos tumores colorrectales también han perdido la función de p53 (v. fig. 8.4), y el ∼40% de los tumores tienen aumento de la actividad de KRAS (v. fig. 8.3).

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FIG. 8.17

Carcinoma de ciego.

Aproximadamente el 1% de los pacientes con cáncer colorrectal tienen el trastorno hereditario PAM por haber heredado la homocigosidad o heterocigosidad compuesta de una mutación con pérdida de función del gen MUTYH. Este síndrome de cáncer hereditario es poco habitual porque muestra un patrón de herencia autosómico recesivo. El gen MUTYH codifica la ADN MYH glucosilasa, que es una de las muchas ADN glucosilasas que contribuyen a la REB del ADN (v. sección 1 en cap. 2). El fenotipo de la PAM generalmente es más leve que el de la PAF, aunque hay mucha variabilidad. El síndrome de Lynch (cáncer de colon no poliposo hereditario) está causado por un problema con la reparación de los errores de emparejamiento del ADN (v. sección 2 en cap. 2). Este síndrome de cáncer hereditario supone el ∼3% de todos los tumores colorrectales y, por ello, es mucho más frecuente que la PAF. Aproximadamente el 70% de los pacientes con síndrome de Lynch heredan un alelo mutante de MLH1 o MSH2, y el resto tienen alelos mutantes de los genes PMS2 o MSH6 (v. tabla 2.1 tabla 2.1 en cap. 2). Con el tiempo, algunas células somáticas, por ejemplo en el colon, adquieren una alteración genética que lleva a la pérdida del alelo funcional restante, lo que altera la reparación de los errores de emparejamiento. Esto hace que se

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acumulen errores de replicación en todo el genoma, especialmente en las repeticiones en tándem cortas (microsatélites; p. ej., A26 o C8). Aparte del cáncer colorrectal (v. fig. 2.5), los pacientes con síndrome de Lynch también tienen un riesgo mucho mayor de presentar otros cánceres, sobre todo de endometrio, vías urinarias superiores, estómago e intestino delgado. Aproximadamente el 15% de los cánceres de colon esporádicos tienen alteraciones en la reparación de los errores de emparejamiento (como en el síndrome de Lynch) y, como consecuencia, contienen ∼700 mutaciones que modifican una secuencia de aminoácidos (esto es ∼10 veces el número de mutaciones en las células capaces de reparar los errores de emparejamiento; v. discusión anterior). Este tipo de cáncer de colon esporádico, además de tumores colorrectales en pacientes con síndrome de Lynch, a veces se denomina fenotipo mutador. Aparte de la pérdida de la reparación de los errores de emparejamiento, casi siempre está activada la transducción de señales de WNT (v. fig. 8.5) (principalmente por pérdida de función de APC), y la vía de RAS/RAF/ERK (v. fig. 8.3) muestra una actividad excesiva (debido fundamentalmente a mutaciones activadoras en los protooncogenes BRAF, KRAS y NRAS). Las pruebas para detectar defectos en la reparación de los errores de emparejamiento suelen realizarse mediante análisis de microsatélites o tinción inmunohistoquímica para detectar las proteínas de reparación de los errores de emparejamiento, tal y como se describe en la sección 2 del capítulo 2. El secuenciado paralelo masivo (v. cap. 4) de un panel de genes que se sabe que causan cáncer de colon hereditario es actualmente una opción para el consejo genético. El tratamiento sistémico del cáncer colorrectal metastásico habitualmente incluye una combinación de fármacos quimioterápicos, como fluorouracilo (v. fig. 37.7 y sección 5.1 en cap. 37), ácido folínico (para amplificar el efecto del fluorouracilo; v. fig. 37.7 y sección 5.1 en cap. 37), y el fármaco con platino oxaliplatino (régimen conocido como FOLFOX; v. también fig. 2.8 y sección 3 en cap. 2) o el inhibidor de la topoisomerasa I irinotecán (régimen conocido como FOLFIRI; v. sección 5 en cap. 1). Los pacientes cuyos tumores tienen una alteración de la reparación de los errores de emparejamiento no reciben tratamiento con fluorouracilo por la falta de efecto beneficioso (cuyo mecanismo no está claro). El tratamiento del cáncer de colon metastásico a menudo se amplifica con fármacos que actúan sobre el receptor de EGF o sobre la transducción de señales del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El VEGF da lugar al crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, por ejemplo en el tejido tumoral. Los anticuerpos anti-EGFR tienen su máxima eficacia en pacientes con genes RAS naturales (RAS está en sentido distal respecto a EGFR; v. fig. 8.3).

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3.5. Melanoma En Estados Unidos, el riesgo que tiene una persona de presentar un melanoma cutáneo a lo largo de toda la vida es del ∼2%. El melanoma cutáneo se origina en los melanocitos de la epidermis, que producen pigmentos con melanina (v. también figs. 35.14 y 35.15). Los melanomas (fig. 8.18) a menudo se reconocen por sus bordes irregulares, su tamaño (>6 mm de diámetro), su color variado y su cambio de aspecto a lo largo del tiempo.

FIG. 8.18

Melanoma.

La radiación UV, la pigmentación cutánea de bajo nivel, los lentigos y un gran número de nevos son factores de riesgo significativos de melanoma maligno cutáneo. La ropa y los protectores solares pueden atenuar significativamente la irradiación UV en el exterior y reducir el riesgo de melanoma, igual que la autoexploración de la piel para detectar lesiones. Los melanomas se clasifican por su forma y tamaño y por la invasión de otras capas de tejido. Los melanomas confinados localmente se pueden tratar fácilmente con cirugía, mientras que los melanomas muy metastásicos tienen mal pronóstico. Muchos pacientes con melanoma metastásico son tratados con inmunoterapia. La inmunoterapia farmacológica favorece el reconocimiento de las células del melanoma por los linfocitos T, seguido por la destrucción de las células tumorales. Aproximadamente el 35% de los pacientes con un melanoma tienen una mutación BRAFV600 que activa constitutivamente BRAF. El vemurafenib y el

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dabrafenib inhiben BRAFV600 y generalmente reducen el volumen de los tumores, aunque a esto lamentablemente le sigue la recaída por resistencia al fármaco. De manera similar, el fármaco trametinib, que inhibe la cinasa MAP/ERK (en sentido distal a BRAF; v. fig. 8.3), es efectivo inicialmente, aunque posteriormente pierde su eficacia. Se consigue un periodo de remisión más prolongado con la combinación de un inhibidor de BRAF y un inhibidor de ERK. Aproximadamente el 25% de los melanomas contienen una mutación activadora del gen NRAS (NRAS está proximal a BRAF en la vía de RTK/RAS/RAF/ERK; v. fig. 8.3). Actualmente no está aprobado ningún fármaco que inhiba la proteína NRAS mutante. La inhibición de la cinasa distal BRAF es (sorprendentemente) contraproducente. El melanoma familiar es un síndrome de cáncer hereditario que en el ∼50% de los pacientes se debe a haber heredado un gen CDKN2A mutante, que codifica p16Ink4a y p14ARF. La prevalencia del melanoma familiar es del ∼4%. p16Ink4a inhibe normalmente los complejos ciclina D/CDK4 y ciclina D/CDK6 (v. figs. 8.1 y 8.2). p14ARF inactiva normalmente MDM2 y, en consecuencia, estabiliza a p53 (v. fig. 8.4). La mayor parte de las mutaciones patógenas del gen CDKN2A llevan a la pérdida de la función solo de p16Ink4a, aunque los pacientes con estas mutaciones también tienen mayor riesgo de cáncer pancreático.

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4. Consumo de glucosa por los tumores Los tumores consumen mucha más glucosa que las células normales. La tomografía por emisión de positrones (PET) de los pacientes después de la infusión de un análogo de glucosa radiactivo ayuda a localizar las metástasis. Incluso las células tumorales bien oxigenadas generan cantidades comparables de adenosina trifosfato (ATP) mediante glucólisis anaeróbica y aeróbica, mientras que las células normales producen casi todo el ATP mediante glucólisis aeróbica. Esta observación se denomina habitualmente efecto Warburg. Todavía no se ha encontrado ninguna explicación aceptada de forma general para el efecto Warburg. La PET con 2-fluorodesoxiglucosa (2FDG) marcada radiactivamente aprovecha el mayor consumo de glucosa por parte de las células tumorales (fig. 8.19; la captación de 2FDG se describe en la sección 6.3 del cap. 19). La PET habitualmente se utiliza para detectar metástasis.

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FIG. 8.19 Imagen frontal fusionada de tomografía por emisión de positrones con 2-18F-desoxiglucosa y tomografía computarizada (obtenida con rayos X) de una paciente con carcinoma epidermoide del cuello uterino. El asterisco marca el tumor primario. La flecha corta indica un adenoma próximo, y las flechas largas muestran ganglios linfáticos en el mediastino. (De Viswanathan C, Bhosale PR, Shah SN, Vikram R. Positron emission tomographycomputed tomography imaging for malignancies in women. Radiol Clin North Am. 2013;51:1111-1125.)

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Resumen ■ Las células quiescentes están en la fase G0. La activación de receptores de factores de crecimiento induce la transición de la fase G0 a la fase G1 mediante la síntesis de la ciclina D, la activación de CDK4 y CDK6 y la fosforilación de RB, que a su vez libera E2F, que altera la transcripción, de manera que se expresan más ciclinas D y E. ■ p53 se activa en respuesta a la fosforilación por las cinasas ATM, ATR, CHK1 y CHK2, que a su vez se activan en respuesta al daño del ADN. p53 activado actúa como factor de transcripción que incrementa la transcripción de los genes que codifican la proteína inhibidora de CDK (CKI) p21 y la molécula proapoptótica BAX. ■ La transducción de señales de WNT mediada por receptores Frizzled lleva a un aumento en la concentración de la β-catenina, que a su vez activa factores de transcripción de la familia TCF/LEF. Los factores de transcripción TCF/LEF incrementan la transcripción del gen MYC y de otros muchos genes. A su vez, MYC es un factor de transcripción que afecta a la transcripción de un gran número de genes. ■ Aproximadamente la mitad de las pacientes con síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario ha heredado un alelo BRCA1 o BRCA2 defectuoso. Las alteraciones genéticas en las células de la mama y otros tejidos que llevan a la pérdida de función del alelo BRCA restante son tumorígenas. Por su efecto de letalidad sintética, los inhibidores de la PARP son especialmente tóxicos para las células tumorales que carecen de BRCA1 o BRCA2 funcional. ■ Los cánceres de pulmón de los fumadores contienen muchas más mutaciones que los cánceres de los no fumadores. El cáncer de pulmón microcítico aparece principalmente en fumadores, se trata con fármacos con platino y se asocia a una tasa de supervivencia baja. Los carcinomas epidermoides también se relacionan con el tabaco y a menudo tienen mutaciones en TP53 y CDKN2A. Los adenocarcinomas (AC) pulmonares, que aparecen tanto en fumadores como en no fumadores, genéticamente son muy diversos, aunque a menudo contienen mutaciones en EGFR, KRAS, TP53 y CDKN2A. ■ Los cánceres de próstata habitualmente contienen un gran número de translocaciones, y su crecimiento está impulsado por los andrógenos. Los tumores son genéticamente muy diversos. El tratamiento farmacológico del cáncer de próstata avanzado a menudo incluye privación de andrógenos y taxanos (inhibidores de la despolimerización de los microtúbulos). ■ La poliposis adenomatosa familiar (PAF) está causada por la

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heterocigosidad para un alelo de APC con pérdida de función. APC interviene en la degradación de la β-catenina en el citosol. La pérdida somática del segundo alelo de APC, el alelo funcional, es tumorígena. Los pacientes afectados tienen de centenares a miles de pólipos en el colon y presentan cáncer de colon salvo que se les realice una colectomía. La mayor parte de los pacientes con cáncer colorrectal esporádico también han perdido la función de la proteína APC. ■ La poliposis asociada a MUTYH (PAM) se debe a la pérdida heredada con un patrón autosómico recesivo de la actividad de la ADN glucosilasa MYH, y es similar a una forma atenuada de PAF. ■ El síndrome de Lynch está causado por la heterocigosidad de un alelo con pérdida de función de una de las proteínas para la reparación de los errores de emparejamiento (en la mayor parte de casos, MLH1 o MSH2). La pérdida somática del segundo alelo, funcional, es tumorígena. Esto causa inestabilidad de los microsatélites. Una pequeña proporción de pacientes con cáncer colorrectal esporádico también han perdido la función de la vía de la reparación de los errores de emparejamiento. El fluorouracilo es ineficaz en estos pacientes. ■ El riesgo de melanoma maligno de la piel aumenta con los lentigos, el número de nevos y la exposición a la luz solar. Además, el ∼2% de la población tiene una mutación del gen CDKN2A que causa melanoma familiar por pérdida de función de p16Ink4a; p16 normalmente inhibe las cinasas CDK4 y CDK6 activadas por la ciclina D. Los pacientes heterocigotos para la pérdida de p16 también tienen mayor riesgo de cáncer pancreático. Aproximadamente un tercio de los pacientes con melanoma esporádico tienen BRAF con la mutación V600E activo de forma constitutiva, y el tratamiento óptimo de las metástasis de estos tumores es la combinación de un inhibidor de BRAF y un inhibidor de MEK. ■ Las células tumorales a menudo consumen más glucosa que las células normales, y se utiliza la PET con 2-18F-desoxiglucosa para localizar las metástasis.

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Lecturas recomendadas ■ Aoude LG, Wadt KA, Pritchard AL, Hayward NK. Genetics of familial melanoma: 20 years after CDKN2A. Pigment Cell Melanoma Res. 2015;28:148–160. ■ Cancer Genome Atlas Research Network.Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 2014;511:543–550. ■ Fearon ER. Colon and rectal cancer. In: Mendelsohn J, Gray JW, Howley PM, Israel MA, Thompson CB, eds. The Molecular Basis of Cancer. Philadelphia, PA: Elsevier-Saunders; 2015:499–513. ■ Hecht SS. Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. J Natl Cancer Inst. 1999;91(14):1194–1210. ■ Mukherjee S. The Emperor of all Maladies: A Biography of Cancer. New York: Scribner; 2010. ■ Renehan AG, Zwahlen M, Egger M. Adiposity and cancer risk: new mechanistic insights from epidemiology. Nat Rev Cancer. 2015;15:484–498. ■ Roos WP, Thomas AD, Kaina B. DNA damage and the balance between survival and death in cancer biology. Nat Rev Cancer. 2016;16:20–33. ■ Roy-Chowdhuri S, de Melo Gagliato D, Routbort MJ, et al. Multigene clinical mutational profiling of breast carcinoma using next-generation sequencing. Am J Clin Pathol. 2015;144:713–721. ■ Tomasetti C, Vogelstein B. Variation in cancer risk among tissues can be explained by the number of stem cell divisions. Science. 2015;347:78–81. ■ Vogelstein B, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz Jr LA, Kinzler KW. Cancer genome landscapes. Science. 2013;339:1546–1558.

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CAPÍTULO 9

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Estructura de las proteínas, y agregados de proteínas en las enfermedades degenerativas Sinopsis ■ Las proteínas están formadas por cadenas lineales de aminoácidos. Durante la traducción se pueden incorporar 21 aminoácidos diferentes a la cadena peptídica naciente. Muchos de estos aminoácidos se pueden modificar después de la traducción. ■ La secuencia, la modificación postraduccional y la diversidad de las propiedades químicas de los aminoácidos dan lugar a una sorprendente variedad de proteínas. ■ Las proteínas mantienen su forma tridimensional mediante numerosos mecanismos, como enlaces de hidrógeno, efectos hidrófobos, interacciones electrostáticas, interacciones de Van der Waals y enlaces cruzados químicos (p. ej., puentes disulfuro). ■ Las estructuras tridimensionales de las proteínas contienen elementos comunes; dos de estos elementos abundantes son la hélice α y la lámina β. ■ Durante el transcurso de la evolución, la mezcla y el emparejamiento dejaron muchos motivos (p. ej., una secuencia de aminoácidos que se une a un nucleótido) formando parte de proteínas que actualmente desempeñan diversas funciones. ■ Las proteínas a menudo contienen dominios que tienen una estructura definida, independientemente de las secuencias que las flanquean. Cada uno de estos dominios tiene una función (p. ej., unión al ADN o soportar y englobar un sustrato en una enzima). ■ Las proteínas se pliegan durante la síntesis y también después, a veces con ayuda de proteínas chaperonas. ■ La estructura tridimensional fisiológica de las proteínas tiene una estabilidad tan solo marginal. Cuando se pierde esta estructura, la proteína ya no tiene la misma función y se dice que está desnaturalizada. Muchas proteínas desnaturalizadas no pueden recuperar su forma fisiológica original por sí solas. ■ Algunas proteínas o porciones de proteínas normalmente no tienen ninguna estructura de orden superior discernible. ■ La desnaturalización de las proteínas en el estómago facilita su digestión

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en el estómago y el intestino, y también destruye patógenos. De manera similar, en los entornos asistenciales se utiliza mucho la desnaturalización y la modificación de las proteínas para destruir patógenos. ■ La agregación intracelular o extracelular patológica de proteínas se encuentra en diversas enfermedades, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la amiloidosis debida a la diálisis crónica.

Objetivos de aprendizaje Para dominar este tema, debería ser capaz de hacer lo siguiente: ■ Explicar las fuerzas que mantienen la mayor parte de las proteínas en su forma nativa. ■ Dibujar un esquema estándar de una hélice α, una lámina β paralela y una lámina β antiparalela. Indicar la localización de las cadenas laterales de los aminoácidos en estas imágenes. ■ Describir las fuerzas y estructuras secundarias que favorecen la agregación de las proteínas. ■ Describir los cambios en la estructura de las proteínas que se producen cuando se las desnaturaliza. ■ Describir los efectos de los desinfectantes de uso habitual (p. ej., yodo, alcoholes, peróxido de hidrógeno y calor) sobre las proteínas. ■ Describir la naturaleza y la estructura básica del amiloide, e indicar qué técnicas lo hacen visible.

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1. Los aminoácidos como bloques de construcción de péptidos y proteínas Los aminoácidos están formados por un grupo NH3+–CH–COO− constante y una cadena lateral variable. La diversidad de las propiedades químicas de las cadenas laterales y la orientación de los aminoácidos en el espacio dan lugar a una gran variedad de funciones de los péptidos y proteínas. Los aminoácidos se pueden ordenar en grupos, los más importantes de los cuales son no polares, polares sin carga y polares con carga.

1.1. Comentarios generales sobre los aminoácidos Los péptidos, polipéptidos y proteínas son polímeros de aminoácidos, que están unidos entre sí mediante enlaces peptídicos (v. sección 2). Un dipéptido está formado por dos aminoácidos, un tripéptido por tres, un tetrapéptido por cuatro, y así sucesivamente. El nombre péptido se utiliza habitualmente para los polímeros que contienen menos de 50 aminoácidos, y se utiliza el nombre proteína para los polímeros que contienen 50 o más aminoácidos. El término polipéptido se utiliza para los péptidos o proteínas que contienen más de ∼15 aminoácidos. Sin embargo, no hay definiciones acordadas de forma general. Los aminoácidos tienen la estructura general H2N–CH(R)–COOH; R representa la denominada cadena lateral (fig. 9.1). Diferentes aminoácidos tienen diferentes cadenas laterales. En solución, a un pH neutro, la porción H2N– se protona a H3N+–, y –COOH se desprotona a –COO− (v. la discusión de los aminoácidos con carga, más adelante). En los péptidos y proteínas, la estructura H2N–CH–COOH se transforma en parte del esqueleto del péptido.

FIG. 9.1

Aminoácidos L y D.

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Hay isómeros L y D de los aminoácidos quirales (v. fig. 9.1). La glicina no es quiral porque R = H, de manera que el átomo de C central tiene dos sustituyentes idénticos. El átomo de C «central» (denominado Cα) de los otros aminoácidos tiene cuatro sustituyentes diferentes y es quiral. En el cuerpo humano, prácticamente todos los aminoácidos de los péptidos y proteínas son isómeros L. Hasta la fecha, en los seres humanos el isómero D se ha encontrado solo en aminoácidos libres (p. ej., D-serina y D-aspartato, que intervienen en la transducción de señales en el sistema nervioso). El ARNm codifica la síntesis de péptidos y proteínas a partir de 21 aminoácidos diferentes. Los nombres de estos aminoácidos, así como sus abreviaturas de tres letras y de una, se muestran en la tabla 9.1. Las secuencias de trinucleótidos del ADN que codifican estos aminoácidos se muestran en la tabla 8.1. La selenocisteína es codificada por una combinación de un codón finalizador UGA y una secuencia de inserción de selenocisteína (SECIS) en la UTR 3′ de un ARNm. Dos ejemplos de proteínas que contienen selenocisteína son glutatión peroxidasa (v. cap. 21) y tiorredoxina reductasa (v. cap. 37). Tabla 9.1 Nombres y abreviaturas de los aminoácidos codificados genéticamente Abreviatura de 1 letra A C D E F G H I K L M N P Q R S T U V W Y

Nombre completo Alanina Cisteína Aspartato Glutamato Fenilalanina Glicina Histidina Isoleucina Lisina Leucina Metionina Asparagina Prolina Glutamina Arginina Serina Treonina Selenocisteína Valina Triptófano Tirosina

Abreviatura de 3 letras Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Sec Val Trp Tyr

1.2. Clasificación de los aminoácidos La figura 9.2 muestra la estructura de los L-aminoácidos codificados genéticamente. Las diferencias de estructura están limitadas a la cadena lateral, excepto en el caso de la prolina, que también contiene un enlace entre

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el grupo amino de la cadena principal y la cadena lateral (por lo tanto, en sentido estricto es un iminoácido).

FIG. 9.2

Estructura de los aminoácidos que los ribosomas incorporan a las cadenas peptídicas nacientes.

El grupo de los aminoácidos no polares contiene diversos subgrupos. La glicina es el menor de todos los aminoácidos, y su cadena lateral es –H. La glicina es el que mayor flexibilidad aporta al trayecto tridimensional del esqueleto de una proteína. Los aminoácidos alifáticos (alanina, valina, leucina, isoleucina) son más hidrófobos conforme aumenta el área de la superficie no polar de su cadena lateral. Las cadenas laterales de los aminoácidos alifáticos a menudo intervienen en los efectos hidrófobos y en las interacciones de Van der Waals (v. sección 3). Estas interacciones

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aparecen, por ejemplo, en el interior de la proteína, entre las proteínas de membrana y los lípidos de membrana, entre proteínas y compuestos orgánicos que son importantes para la función de las proteínas, y entre enzimas y sustratos. Los aminoácidos con azufre en la cadena lateral son metionina y cisteína. La metionina es habitualmente el primer (es decir, Nterminal) aminoácido de una proteína recién sintetizada, aunque este residuo suele eliminarse durante el procesado postraduccional. Dos cadenas laterales de cisteína se pueden oxidar para formar un enlace disulfuro (–S–S–, también denominado puente disulfuro). Estos enlaces disulfuro suelen ser un determinante importante de la estructura final de una proteína. La fenilalanina y el triptófano son aminoácidos no polares que tienen cadenas laterales aromáticas hidrófobas. Las cadenas laterales aromáticas necesitan un espacio relativamente grande. Los anillos de benceno de Phe y Trp pueden contener un ion pequeño o un grupo metilo, o un anillo de benceno de otra molécula. La cadena lateral de la prolina está unida al átomo de N del grupo invariante NH2+–CH–COO− y crea un anillo, lo cual reduce la flexibilidad del grupo NH2+–CH–COO− e impone limitaciones estéricas adicionales al esqueleto del péptido. Por este motivo, como se detalla en la sección 4.1, la prolina induce un giro en las hélices α. Por otro lado, la prolina, igual que la glicina, puede contribuir a formar un giro brusco de la cadena peptídica y, por ello, se encuentra a menudo en estos giros (v. sección 4). La selenocisteína se encuentra en algunas enzimas que utilizan este residuo cerca de su sitio catalítico. Más arriba se han presentado ejemplos. El grupo de aminoácidos polares sin carga incluye los aminoácidos que tienen un grupo hidroxilo o un grupo amido en la cadena lateral. La tirosina, igual que la fenilalanina y el triptófano, que ya se han mencionado, tiene una cadena lateral aromática, pero su cadena lateral también es polar debido al grupo hidroxilo. El grupo hidroxilo se puede fosforilar o sulfatar. La fosforilación de la tirosina tiene una función importante en la transducción de señales de los factores de crecimiento (v. caps. 26 y 33). La serina y la treonina también tienen en la cadena lateral un grupo hidroxilo que se puede conjugar con fosfato, sulfato o un polisacárido. La fosforilación de Ser o Thr es un mecanismo regulador habitual para alterar las propiedades de una proteína. La glutamina y la asparagina contienen grupos amido (–CO–NH2). El grupo NH2 puede donar uno o dos átomos de hidrógeno, mientras que el grupo C = O puede aceptar uno o dos átomos de hidrógeno para formar uno o más enlaces de hidrógeno (v. sección 3.2). Estas cadenas laterales son muy hidrófilas porque pueden formar enlaces de hidrógeno con agua. El grupo de los aminoácidos polares con carga incluye aspartato, glutamato, lisina, arginina e histidina. Las cadenas laterales del aspartato y el glutamato acaban en –COO−. El pK del grupo carboxilo (–COOH) está en el intervalo de 4 a 5. A un pH mayor que el pK, la mayor parte de los grupos carboxilo pierden un protón y tienen carga negativa (–COO−). Los grupos carboxilo con carga negativa del glutamato y el aspartato a menudo

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establecen interacciones electrostáticas con otros grupos. Además, el grupo carboxilo también forma enlaces de hidrógeno. El glutamato y el aspartato frecuentemente se encuentran cerca de los centros catalíticos de enzimas o en los sitios de interacción proteína-proteína. La lisina y la arginina tienen cadenas laterales con carga positiva. El pK del grupo amino (–NH2) de la lisina es ∼10, y el pK de =NH del grupo guanidino [–NH–C(NH)–NH2] de la arginina es ∼12. A un pH menor que estos valores de pK, la mayor parte de los grupos amino y guanidino ganan un protón y tienen carga positiva (– NH3+, –NH–C(NH2+)–NH2), como se muestra en la figura 9.2. Las cadenas laterales de la lisina y la arginina (igual que las del glutamato y el aspartato, como ya se ha mencionado) forman interacciones electrostáticas, además de enlaces de hidrógeno. En las proteínas que se unen al ADN, la lisina y la arginina frecuentemente coordinan las porciones fosfato con carga negativa de los desoxirribonucleótidos. En las enzimas que requieren los grupos prostéticos biotina o ácido lipoico, el grupo prostético está unido covalentemente al grupo amino de la cadena lateral de una lisina cerca del sitio catalítico (v. caps. 10 y 22). En las histonas, la cadena lateral de la lisina a menudo se modifica con grupos metilo o acetilo; estas modificaciones afectan a la compactación y la transcripción del ADN (v. caps. 1 y 6). A un pH menor de ∼6-7 (dependiendo del entorno exacto para cada proteína particular), la mayor parte de las cadenas laterales de la histidina también tienen carga positiva. La histidina es a menudo donante y aceptador de H+ en el sitio activo de enzimas que catalizan la transferencia de H+.

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2. Enlaces peptídicos, puentes disulfuro y enlaces cruzados Un enlace peptídico une covalentemente el grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo amino de otro aminoácido, dando lugar así a péptidos y proteínas. El enlace peptídico (C–N en –CO–NH–) tiene características de doble enlace parcial, lo que limita la flexibilidad conformacional de péptidos y proteínas. Los péptidos o proteínas pueden estar unidos entre sí por puentes disulfuro o enlaces cruzados.

2.1. Enlaces peptídicos En los péptidos, el grupo carboxilo de un aminoácido (se muestra en negro en la fig. 9.3) se une al grupo amino de otro aminoácido (se muestra en azul) mediante un enlace peptídico (un enlace amido). El esqueleto peptídico de los péptidos o proteínas es la secuencia repetitiva –N–CH–CO– unida por enlaces peptídicos que es común a todos los aminoácidos.

FIG. 9.3 Naturaleza del enlace peptídico. Se muestra el enlace peptídico en la configuración trans, que es la más frecuente. La configuración cis (rotación de 180° alrededor del enlace C-N) se produce sobre todo con la prolina.

El enlace peptídico (C–N en –CO–NH–) tiene características de doble enlace parcial y no puede girar libremente (v. fig. 9.3); los otros enlaces del esqueleto del péptido, N–Cα y Cα–C, son verdaderos enlaces sencillos, aunque su rotación está limitada por impedimento estérico (es decir, no se permite que los átomos invadan el espacio de otros). Pese a todo, hay suficiente flexibilidad para permitir que la cadena polipeptídica adopte una inmensa variedad de conformaciones, que van desde la improbable conformación totalmente extendida hasta la habitual estructura plegada, funcional, energéticamente favorable y compacta (se puede ver el plegado de

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las proteínas en la sección 4). Los aminoácidos con cadenas laterales pequeñas (p. ej., glicina) aportan al esqueleto del péptido más flexibilidad conformacional que los aminoácidos con cadenas laterales voluminosas (p. ej., triptófano). La prolina, que tiene un grupo imino fijo en un anillo, en lugar de un grupo amino que puede girar, limita localmente el esqueleto a una gama especialmente limitada de conformaciones. La estructura primaria de un péptido o proteína es la secuencia lineal de residuos de aminoácidos desde el extremo N hasta el C. En el extremo Nterminal, una proteína recién sintetizada tiene un grupo amino [+H3N–] y en el extremo C-terminal, un grupo carboxilo [–COO−]. Como se indica en el capítulo 1, la secuencia del ADN se describe en sentido 5′→3′. Los aminoácidos del extremo N-terminal de una proteína están codificados en el lado 5′ de la cadena codificante de un gen y en el lado 5′ de un ARNm (v. caps. 6 y 7). Cuando los ribosomas sintetizan una proteína, comienzan con el aminoácido N-terminal.

2.2. Puentes disulfuro y otros enlaces cruzados Los grupos –S–H de las cadenas laterales de dos residuos de cisteína se pueden oxidar para formar un enlace –S–S–, que se denomina puente disulfuro o enlace disulfuro. Se puede formar un puente disulfuro tanto en un único polipéptido (p. ej., albúmina sérica humana; v. fig. 9.6) como entre las subunidades de un complejo de proteínas (p. ej., entre las subunidades del receptor de insulina). Las cadenas laterales de la lisina se pueden oxidar y después formar enlaces cruzados; esto ocurre con el colágeno y la elastina en la matriz extracelular, por ejemplo, y da lugar a estructuras grandes y resistentes (v. caps. 12 y 13). Aparte de la formación ocasional de enlaces cruzados covalentes (en ocasiones entre subunidades de proteínas), la estructura tridimensional de una proteína natural plegada se estabiliza con multitud de interacciones no covalentes entre átomos (v. secciones 3 y 4).

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3. Fuerzas que determinan la conformación de proteínas y péptidos Numerosas interacciones entre átomos estabilizan la estructura tridimensional de péptidos y proteínas. Estas interacciones incluyen enlaces de hidrógeno, efectos hidrófobos, interacciones electrostáticas e interacciones de Van der Waals.

3.1. Efectos hidrófobos Cuando moléculas hidrófobas están en contacto con agua, alteran la estructura normal del agua, formada por enlaces de hidrógeno. La tendencia del sistema global a adoptar el estado de menor energía posible hace que las moléculas hidrófobas se unan entre sí cuando se encuentran en agua. Esto permite la máxima formación de enlaces de hidrógeno entre las moléculas de agua. (De igual manera, cuando se vierten algunas gotas de aceite en agua, tienden a confluir en una única mancha.) Los efectos hidrófobos constituyen hasta el ∼90% de las fuerzas que mantienen una proteína con forma de glóbulo. El resto del impulso que mantiene la forma fisiológica normal de una proteína deriva de los enlaces de hidrógeno, las interacciones iónicas y las fuerzas de Van der Waals (v. más adelante). Los efectos hidrófobos son una importante fuerza impulsora no solo de la conformación de cada proteína única, sino también de la interacción de las proteínas con otras moléculas. Por ejemplo, las proteínas pueden interactuar con otras proteínas mediante cremalleras de leucina, que a menudo se encuentran en los factores de transcripción (v. fig. 6.6). Una proteína se puede fijar a una membrana lipídica por los efectos hidrófobos entre las cadenas laterales de aminoácidos y las colas de ácidos grasos o el colesterol de la membrana. En las proteínas con actividad enzimática, las cadenas de aminoácidos hidrófobos a menudo forman un entorno sin agua para la reacción química catalizada por la enzima. En otras proteínas, los efectos hidrófobos suelen contribuir de manera importante a la unión a compuestos orgánicos, lo que permite que influyan en sus características (p. ej., el hemo en la hemoglobina; v. cap. 14). En general se encuentran cantidades aproximadamente iguales de aminoácidos hidrófobos en la superficie y el interior de las proteínas. A menudo se sugiere de forma errónea que los aminoácidos hidrófobos se encuentran casi exclusivamente en el interior de las proteínas. Sin embargo, incluso la ocultación parcial de las cadenas laterales hidrófobas es favorable desde el punto de vista energético, y, por lo tanto, las cadenas laterales hidrófobas de la superficie de la proteína ayudan a una proteína a adoptar una forma globular compacta. Además, las propiedades químicas de las

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cadenas laterales de muchos aminoácidos hidrófobos son bastante complejas. Así, las cadenas laterales del triptófano y la tirosina tienen una porción hidrófoba (el anillo bencénico) y una porción hidrófila (la porción >N–H del segundo anillo del triptófano y el grupo –OH del anillo bencénico de la tirosina) que pueden participar en la formación de enlaces de hidrógeno (>NH y –OH son donantes de hidrógeno; –O– es un aceptador de hidrógeno). Por lo tanto, el triptófano y la tirosina a menudo se encuentran en la interfase entre la porción hidrófoba de la bicapa lipídica de la membrana y los grupos de las cabezas de los fosfolípidos, más hidrófilos (es decir, entre las colas hidrófobas de los ácidos grasos de los fosfolípidos y los grupos carbonilo que forman parte del enlace éster –CO–O– entre los ácidos grasos y la porción de glicerol de los fosfolípidos; v. cap. 11).

3.2. Enlaces de hidrógeno Se forman enlaces de hidrógeno cuando dos átomos electronegativos se unen parcialmente a un átomo de hidrógeno. Para ello un donante de hidrógeno, como –OH o –NH, debe interactuar con un aceptador de hidrógeno, como –O o –N. Si se forma un enlace de hidrógeno entre –N–H y O–, a menudo se representa esquemáticamente como –N–H⋅⋅⋅⋅⋅O–. Los átomos de carbono no son suficientemente electronegativos como para participar en los enlaces de hidrógeno. El esqueleto del péptido contiene donantes de hidrógeno en la porción –N– H y aceptadores de hidrógeno en la porción =O de cada grupo amido (–CO– NH–; fig. 9.4); sin embargo, por motivos estéricos, el donante y el aceptador deben proceder de diferentes residuos de aminoácidos (v. secciones 4.1 y 4.2).

FIG. 9.4 Enlaces de hidrógeno en las proteínas. El número máximo de enlaces de hidrógeno que se puede esperar que se formen se muestra en rojo. En la naturaleza, los átomos que aquí forman dos enlaces de hidrógeno muchas veces forman solo un enlace de hidrógeno.

Las cadenas laterales de los aminoácidos contienen los donantes de hidrógeno –O–H (en Ser, Thr y Tyr), –N–H (en Trp, Asn, Gln, Lys, Arg e His), –S–H (en Cys) y –Se–H (en Sec), además de los aceptadores de hidrógeno =O

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(en Asn, Gln, Asp y Glu), –O– (en Ser, Thr y Tyr) y –N= (en His). El agua puede actuar como donante y aceptador de hidrógeno. La formación de un enlace de hidrógeno generalmente libera el ∼6% de la energía necesaria para la formación de un enlace covalente C–C. La reacción de un donante de hidrógeno con un aceptador dentro de un polipéptido es energéticamente más favorable que la reacción con las moléculas de agua circundantes. La formación de enlaces de hidrógeno entre los átomos del esqueleto del péptido estabiliza las hélices α y las láminas β del péptido (v. secciones 4.1 y 4.2).

3.3. Interacciones electrostáticas Las interacciones electrostáticas son la consecuencia de la atracción entre cargas diferentes y la repulsión entre cargas iguales. Los átomos del esqueleto del péptido prácticamente no están cargados, excepto los extremos amino y carboxilo terminales. Las cadenas laterales de los aminoácidos Asp y Glu tienen carga negativa (v. fig. 9.2), mientras que las de Lys y Arg (y a veces His) tienen carga positiva. La molécula de agua es un dipolo: su átomo de O aporta aproximadamente dos tercios de una carga negativa, y los átomos de hidrógeno aportan cada uno aproximadamente un tercio de una carga positiva. Si un aminoácido cargado se introduce en agua, las moléculas de agua se orientan alrededor del aminoácido en función de la atracción y repulsión de cargas. Por ejemplo, si el grupo –COO− de una cadena lateral de glutamato está orientado hacia el agua, las moléculas de agua se ordenan de tal manera que sus átomos de H están más cerca de la carga negativa de – COO−, mientras que sus átomos de O están más alejados de la carga negativa de –COO−. La eliminación de una única carga de la superficie de una proteína, y su ocultación en el interior de la proteína, conlleva una penalización energética muy elevada (hasta el ∼50% de la energía necesaria para la formación de un enlace C–C covalente). Por lo tanto, casi todos los residuos con carga están en la superficie de una proteína, y si un residuo con carga está en el interior, casi siempre interactúa con una carga opuesta próxima. La arginina y la lisina llevan sus grupos con carga positiva en el extremo de una cadena lateral algo hidrófoba. En las proteínas de membrana, buena parte de esta cadena puede estar situada cerca de la porción hidrófoba de las membranas lipídicas (v. cap. 11), y la porción con carga positiva puede interactuar con los grupos fosfato con carga negativa de los fosfolípidos (se dice que la arginina y la lisina «bucean»).

3.4. Interacciones de Van der Waals El término fuerzas de Van der Waals se utiliza de forma poco coherente. Originalmente el término se refería a todas las fuerzas de atracción entre moléculas que influyen en el comportamiento de los gases. Las fuerzas de

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Van der Waals en el sentido original incluyen las interacciones entre moléculas que tienen un dipolo permanente, inducido o transitorio. Una molécula tiene un dipolo cuando el centro de su carga positiva difiere del centro de su carga negativa (es decir, habitualmente cuando un átomo más electronegativo atrae los electrones más que un átomo menos electronegativo). En este caso el dipolo es permanente (p. ej., un grupo carbonilo, que contiene un ligero exceso de carga negativa en el O y un ligero exceso de carga positiva en el C). Un dipolo es transitorio cuando simplemente se debe al movimiento de los electrones alrededor de los núcleos (un ejemplo sería una molécula de H2, que tiene dos núcleos y dos electrones). Se dice que un dipolo es inducido si aparece en respuesta a la aparición en la proximidad de una carga (p. ej., la carga de la cadena lateral de un aminoácido como glutamato o lisina). En este libro se utiliza el término interacciones de Van der Waals para describir las interacciones débiles y de corto alcance debidas a una combinación de las siguientes fuerzas: atracción entre el núcleo con carga positiva de un átomo y los electrones con carga negativa de otro átomo, interacciones electrostáticas entre átomos portadores de una carga ligera por la presencia de un momento dipolar y repulsión de electrones entre orbitales llenos de electrones. Pueden aparecer interacciones de Van der Waals favorables entre todos los tipos de átomos, son extremadamente sensibles a la distancia entre átomos, y requieren que los átomos estén muy próximos entre sí.

3.5. Coordinación de iones metálicos Los iones metálicos (p. ej., Ca2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Zn2+ o Cu2+) a menudo se coordinan con las cadenas laterales de los aminoácidos. Un ejemplo bien conocido de este fenómeno son los dedos de Zn de los receptores de hormonas esteroideas, que se unen al ADN, y en los que cuatro residuos (≥2 Cys; el resto, His) se coordinan con Zn2+. Una hélice α (v. sección 4.1) de un único dedo de Zn habitualmente se une al surco grande del ADN y lee ∼3 bases.

3.6. Entropía La entropía es una fuerza que actúa contra la estabilidad de la conformación natural de las proteínas. Todos los sistemas químicos tienen a maximizar su entropía. Las proteínas tienen la máxima entropía cuando los grupos químicos que las componen se mueven libremente en el espacio. Sin embargo, en la estructura nativa de las proteínas los átomos están muy próximos unos a otros (impulsados por las fuerzas descritas en las secciones 3.1 a 3.5), y por ello sus grupos químicos tienen una libertad de movimiento reducida. Cuando se calienta una proteína hasta una temperatura elevada y no fisiológica, la proteína gana entropía. El aumento del movimiento anula

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las fuerzas de atracción no covalentes (desde los efectos hidrófobos hasta las interacciones de Van der Waals), y la proteína pierde su estructura nativa. Entonces la proteína está en un estado desnaturalizado (v. sección 6). Muchas mutaciones patógenas reducen apreciablemente la estabilidad de una proteína al reducir las interacciones favorables de grupos funcionales y átomos. La estabilidad se puede estudiar exponiendo la proteína (habitualmente una enzima) in vitro a una temperatura anormalmente elevada y no fisiológica.

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4. Elementos de la estructura tridimensional de las proteínas Hay algunas conformaciones muy habituales del esqueleto del péptido. Las más importantes son la hélice α y la lámina β. Aproximadamente dos tercios de los aminoácidos de las proteínas globulares forman parte de una hélice α o de una lámina β. Las hélices α son estructuras compactas en las que el esqueleto del péptido forma una espiral a lo largo de un cilindro central, y las cadenas laterales se proyectan desde el cilindro hacia la periferia. Las láminas β están formadas por segmentos de péptido que se alinean unos próximos a otros en un patrón paralelo o antiparalelo. Tanto las hélices como las láminas deben su estabilidad a los enlaces de hidrógeno entre los grupos –N–H y –C = O de los péptidos. Los segmentos de péptido que conectan las hélices y las láminas se denominan estructuras en bucle. Habitualmente tienen una estructura tridimensional ordenada. A excepción de los bucles cortos, difieren de unas proteínas a otras.

4.1. Hélice α El esqueleto del péptido compone el núcleo de una hélice α, mientras que las cadenas laterales de los aminoácidos señalan hacia la periferia de la hélice (fig. 9.5).

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FIG. 9.5 Conformación de una hélice α en la globina β humana. La globina β es un componente de la hemoglobina A humana (v. cap. 16). Los aminoácidos de la hélice C-terminal de la globina β se muestran en naranja. En la parte inferior izquierda, la hélice naranja se curva hacia abajo desde la parte superior. Para la secuencia de Ala-140 a His-143 (parte inferior de la hélice naranja), los átomos de N se muestran en azul, y los de O en rojo. Cada globina β contiene varias hélices α adicionales (algunas se muestran en gris). La imagen de la derecha muestra la misma hélice C-terminal con los átomos en modelo de espacio lleno (utilizando los radios de Van der Waals). La imagen superior muestra una vista superior a lo largo del eje longitudinal de la misma hélice. Se ven los átomos de los residuos de aminoácidos 130-134 (a mitad de trayecto en la hélice) en modelo de espacio lleno. Obsérvese que no hay espacios vacíos en el centro de la hélice. (Basado en el archivo de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 1HBB de Kavanaugh JS, Rogers PH, Case DA, Arnone A. High-resolution X-ray study of deoxyhemoglobin Rothschild 37 beta Trp—Arg: a mutation that creates an intersubunit chloride-binding site. Biochemistry. 1992;31:4111-4121.)

En un sentido muy general, aproximadamente un tercio de todos los residuos de aminoácidos de las proteínas forman parte de hélices α; sin embargo, esta fracción varía mucho de unas proteínas a otras. Una hélice α típica de una proteína globular contiene ∼12 aminoácidos y tiene ∼3 vueltas (una proteína globular tiene una longitud menor de ∼4 veces su anchura). El núcleo de la hélice α está empaquetado lo suficiente como para que puedan tener lugar interacciones de Van der Waals entre átomos. Además, cada nitrógeno amídico del esqueleto del péptido [–(CO)–NH–] forma un enlace de hidrógeno con un grupo carbonilo [>C = O] alejado cuatro residuos

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en la cadena peptídica. La hélice α tiene 3,6 residuos de aminoácidos por vuelta y se eleva 5,4 Å (54 nm) por vuelta. Los ejes longitudinales de los enlaces de hidrógeno tienen aproximadamente la misma dirección que el eje longitudinal de la hélice. En la figura 9.5 se ilustran estos principios para la globina β. Los aminoácidos del extremo de una hélice deben encontrar residuos especiales para formar enlaces de hidrógeno. Aminoácidos como la glicina y la prolina son particularmente adecuados para formar un casquete en una hélice. La prolina, debido a su estructura (carece de –NH cuando está en un enlace peptídico), interrumpe la formación de enlaces de hidrógeno en una hélice α, excepto en la primera vuelta de la hélice. La mutación de un residuo de aminoácido del interior de una hélice que se transforma en prolina habitualmente es deletérea porque crea una torsión o una rotura en la hélice y, por ello, probablemente modifica la estructura de otras partes de la proteína. En los esquemas de las estructuras de las proteínas, las hélices habitualmente se muestran como tornillos o cilindros. La figura 9.6 muestra la estructura de la albúmina sérica humana como ejemplo de un esquema de este tipo.

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FIG. 9.6

Esquemas de la albúmina sérica humana formando un complejo con ácidos grasos. Las hélices α se muestran como espirales en A y cilindros en B. A muestra también los enlaces disulfuro (los átomos de S se muestran en modelo de espacio lleno). Se muestran cuatro moléculas de ácido graso unidas, como los átomos rellenos. (Basado en el archivo de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 1BJ5 de Curry S, Mandelkow H, Brick P, Franks N. Crystal structure of human serum albumin complexed with fatty acid reveals an asymmetric distribution of binding sites. Nat Struct Biol. 1998;5:827-835.)

La secuencia de aminoácidos a menudo es tal que un lado de la hélice es hidrófobo, mientras que el otro es muy hidrófilo. Un ejemplo es el motivo cremallera de leucina (v. fig. 6.6), que se puede dimerizar debido a los efectos hidrófobos estabilizadores. Las regiones transmembranarias de las proteínas a menudo son αhelicoidales (se ve un ejemplo en la fig. 11.8). En los canales iónicos, un lado de una hélice de este tipo en ocasiones contiene principalmente residuos de aminoácidos hidrófobos, mientras que el otro contiene principalmente residuos hidrófilos. El lado hidrófobo de la hélice mira hacia el núcleo hidrófobo de la membrana, y el lado hidrófilo puede formar parte de un poro transmembranario hidrófilo. Dos o más hélices α largas pueden formar una espiral enrollada (fig. 9.7). Estas estructuras se encuentran, por ejemplo, en algunos factores de transcripción que se dimerizan sobre los promotores del ADN (v. cap. 6) y en los complejos SNARE, que intervienen en el anclaje de las vesículas secretoras a la membrana plasmática. Estos complejos SNARE son importantes, por ejemplo, en la neurotransmisión, la secreción de hormonas peptídicas (v. cap. 26) y el tránsito intracelular (p. ej., inserción de transportadores de glucosa GLUT-4 en la membrana plasmática; v. cap. 18). Las espirales enrolladas deben su estabilidad principalmente a los efectos hidrófobos.

FIG. 9.7 Las proteínas SNARE pueden formar una espiral enrollada. (Basado en el archivo de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 1SFC de Sutton RB, Fasshauer D, Jahn R, Brunger AT. Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4 A resolution. Nature. 1998;395:347-353.)

Muchos colágenos forman una triple hélice (v. fig. 13.1), una estructura muy diferente de una hélice α.

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4.2. Láminas β Las denominaciones α y β para la hélice y la lámina, respectivamente, tienen raíces históricas. Las hélices se encontraron por primera vez en la queratina α, y las láminas en una queratina β (actualmente se conocen muchas queratinas; se encuentran en el cabello, la piel y las uñas, y también forman parte de los filamentos intermedios de prácticamente todas las células). Las estructuras de las proteínas en hélice α y lámina β se describieron por primera vez en 1951, mientras que la doble hélice del ADN se descubrió en 1953. Para que se forme una lámina β, deben interactuar dos o más cadenas (llamadas cadenas β) de una o más proteínas. En cada cadena, los átomos de O del carbonilo de aminoácidos consecutivos señalan de forma alterna en direcciones opuestas (como extrañas cremalleras con dientes que señalan en direcciones opuestas; fig. 9.8). Los átomos de O de los grupos carbonilo y los átomos NH de los grupos amido de cada cadena forman enlaces de hidrógeno intercatenarios. En consecuencia, dos cadenas β forman un conjunto de enlaces de hidrógeno, tres cadenas forman dos conjuntos, y así sucesivamente. Por ello, un aumento en el número de cadenas que interactúan incrementa el número de enlaces de hidrógeno por cadena, lo que tiende a favorecer las láminas β de tamaño ilimitado (v. también a continuación).

FIG. 9.8 Modelo de la estructura cristalina de la proteína transportadora de ácidos grasos del cerebro humano formando un complejo con ácido oleico. Esta proteína contiene 10 cadenas β (recuadro superior izquierdo; se muestran como flechas con forma de cinta) que intervienen en la formación de la lámina β.

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Las tres cadenas de la parte superior izquierda se muestran en la imagen central como modelos de varillas con los átomos de C, N y O en gris, azul y rojo, respectivamente. No se muestran los átomos de H. Los átomos de O del esqueleto son oxígenos de grupos carbonilo (>C = O), y los átomos de N del esqueleto están unidos a un átomo de H (no se muestra). Estos átomos de H intervienen en los enlaces de hidrógeno (líneas discontinuas negras). Los enlaces de hidrógeno están en un plano aproximadamente perpendicular a la línea de visión. Por el contrario, las cadenas laterales de los aminoácidos se proyectan por encima y por debajo del plano perpendicular a la línea de visión. Las flechas grises sólidas de la parte inferior izquierda indican la dirección de las cadenas (del extremo N al C); las tres cadenas resaltadas tienen organización antiparalela. Las cadenas resaltadas tienen 10, 8 y 9 residuos de aminoácidos de longitud. Dos residuos de aminoácidos que conectan cadenas antiparalelas adyacentes son horquillas y se muestran en color magenta. El ácido oleico se muestra con los átomos en modelo de espacio lleno (se omiten los átomos de H). El ácido oleico está en una conformación plegada debido a su doble enlace y a la influencia del entorno proteínico. El recuadro de la parte superior derecha muestra una vista hacia abajo en el eje longitudinal de la cadena central (azul violáceo claro). Las cadenas a ambos lados (azul claro y azul oscuro) no son perfectamente paralelas a la cadena central. Por lo tanto, sus esqueletos peptídicos siguen direcciones ligeramente diferentes, lo que crea una curvatura en la lámina β (fenómeno frecuente). Las cadenas laterales señalan hacia lados opuestos de la lámina β. El recuadro de la parte inferior derecha muestra todos los átomos de las tres cadenas β seleccionadas en un modelo de espacio lleno (no se muestran los átomos de H, y la visión del ácido oleico está obstruida casi por completo). Una de cada dos cadenas laterales de las tres cadenas β señala en dirección al observador. (Basado en el archivo de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 1FE3 de Balendiran GK, Schnutgen F, Scapin G, et al. Crystal structure and thermodynamic analysis of human brain fatty acid-binding protein. J Biol Chem. 2000;275:27045-27054.)

En algunas láminas β las cadenas son paralelas y en otras son antiparalelas en relación con la dirección extremo N→extremo C del esqueleto del péptido. Si las cadenas de un único polipéptido tienen dirección antiparalela, solamente dos aminoácidos adicionales son suficientes para realizar un giro (denominado horquilla β; v. fig. 9.8 y sección 4.3). En consecuencia, si estas cadenas son paralelas, una secuencia interpuesta mucho mayor debe cubrir la distancia desde el extremo de una cadena β hasta el comienzo de la siguiente cadena β. En los esquemas de la estructura de las proteínas, las cadenas de una lámina β habitualmente se muestran como cintas planas, y una flecha en el extremo a veces indica la dirección N→C. La figura 9.8 muestra la estructura de la lámina β en la proteína transportadora de ácidos grasos del encéfalo. La lámina β está formada por cadenas antiparalelas y se enrolla hasta formar una estructura cilíndrica. Esta proteína incrementa la solubilidad efectiva de los ácidos grasos en el citosol y también protege la célula de los efectos detergentes de los ácidos grasos (v. cap. 27). Cuando un esquema muestra dos cintas (es decir, cadenas β) una al lado de otra, hay enlaces de hidrógeno uniendo las cintas, y están en el plano aproximado de las dos cintas (v. fig. 9.8). Las cadenas laterales señalan en ángulo recto respecto al plano de la cinta y alternan entre los dos lados de la cinta.

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Las proteínas globulares a menudo tienen estructuras de lámina β paralela y también antiparalela. Las proteínas fibrosas (proteínas que tienen una longitud >10 veces su anchura) a veces tienen una estructura de lámina β antiparalela, aunque en general no tienen estructura paralela. Las láminas β normalmente están curvadas. Varias cadenas β pueden formar una lámina β única curvada, casi cilíndrica, que se denomina barril β. Además, dos o más láminas β más los bucles de conexión pueden formar los lados de un cuerpo poligonal; esta disposición de láminas β se denomina hélice β Otro tipo de estructura se denomina propulsor β; cada hoja está formada por una lámina β, de tal manera que las cadenas β más próximas al centro del propulsor son las más cortas, y las más alejadas del centro son las más largas.

4.3. Bucles El término bucle se refiere a la porción de una cadena polipeptídica que conecta elementos de estructura secundaria (es decir, hélices α y láminas β). Los bucles o espirales pueden tener un tamaño muy variable y pueden moverse con bastante libertad o tener una estructura fija que no es helicoidal ni laminar. En las representaciones de la estructura de las proteínas, los bucles habitualmente se muestran como líneas finas. En las proteínas globulares, aproximadamente un tercio de todos los residuos de aminoácidos forman parte de bucles. Un giro β habitualmente está formado por cuatro residuos de aminoácidos y puede realizar un cambio de dirección de ∼180° del esqueleto del péptido. En una lámina β con cadenas β antiparalelas, el primer residuo de un giro β y el último suelen formar parte de la lámina β; el segundo residuo y el tercero forman entonces una horquilla β (v. sección 4.2 y fig. 9.8). El segundo residuo (es decir, el residuo que hay después de una cadena β) suele ser Gly, Asp, Asn o Pro.

4.4. Motivos y dominios Un motivo es un patrón de secuencia proteica que se ha conservado a lo largo de la evolución y transmite a diversas proteínas una propiedad predecible. Por ejemplo, Gly*Gly**Gly (* = cualquier residuo de aminoácido único) es un motivo que ayuda a una proteína a unirse a un nucleótido. Evidentemente, estos motivos están incrustados en los residuos de aminoácidos vecinos (y estructuralmente dependen de ellos). Un dominio está formado por un fragmento contiguo de residuos de aminoácidos que puede funcionar independientemente de otras porciones de la cadena polipeptídica y que también es distinto de ellos físicamente. Por ejemplo, entre los receptores nucleares (v. fig. 6.5), un dominio de unión al ligando se une al ligando, un dominio de dimerización media la dimerización del receptor cuando está unido a un ligando, y un dominio de unión al ADN

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permite que la proteína se fije al ADN. Otro ejemplo es la glucocinasa, que contiene dos dominios que se aproximan cuando se une la glucosa (v. fig. 10.2; el dominio grande es azul, y el dominio pequeño es dorado con una hélice resaltada en rojo). A veces los dominios están conectados por bisagras, que son segmentos cortos y flexibles que permiten el movimiento de un dominio en relación con otro; estos movimientos muchas veces son un prerrequisito para la catálisis enzimática.

4.5. Estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas El término estructura primaria se refiere a la secuencia de aminoácidos de una proteína (p. ej., Met–Leu–Ser–Ala–). El término estructura secundaria se refiere a los elementos que se ven repetidamente en la estructura tridimensional de las proteínas. Este término incluye hélices y láminas. Algunos autores consideran que las estructuras comunes (p. ej., giros β) forman parte de la estructura secundaria, mientras que otros los consideran una estructura terciaria (v. más adelante). A veces se utiliza el término estructura supersecundaria, que se refiere a la estructura de tan solo algunas (a menudo tres) hélices α y láminas β. El término estructura terciaria se refiere a la descripción de la localización relativa de todos los átomos de una proteína en el espacio. Algunos de estos átomos forman parte de hélices α, láminas β, giros β, otros bucles, motivos o dominios. El término estructura cuaternaria se utiliza para describir la composición y la estructura de un complejo de proteínas. La hemoglobina es un ejemplo de un complejo de proteínas de este tipo. Como se detalla en el capítulo 16, la hemoglobina está formada por un heterotetrámero de subunidades de globina (p. ej., dos moléculas de globina α y dos moléculas de globina β, cada una con un grupo hemo unido; v. fig. 16.7). La conformación de cualquier subunidad de globina afecta a la conformación de todas las demás subunidades de globina.

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5. Proteínas no estructuradas Algunas proteínas o regiones de proteínas carecen de una estructura secundaria reconocible, lo que puede conferir ventajas para la modificación de la proteína y su unión a otras proteínas. En comparación con las proteínas globulares estructuradas, las proteínas con alteraciones intrínsecas o las regiones alteradas de las proteínas contienen menos aminoácidos hidrófobos y más aminoácidos polares. También contienen más aminoácidos con carga. Por lo tanto, el efecto hidrófobo, que contribuye mucho a la estabilidad de una proteína estructurada, tiene un efecto significativamente menor sobre la estructura de las regiones con alteraciones intrínsecas. Además, las proteínas con alteraciones intrínsecas contienen más glicina y prolina que las proteínas bien estructuradas. La glicina añade flexibilidad (y entropía). La prolina atenúa la formación de hélices α y láminas β. La falta de estructura en las regiones intrínsecamente alteradas de las proteínas puede facilitar la modificación postraduccional por enzimas y la unión a otras moléculas. La fosforilación, la sulfación y la acetilación pueden afectar significativamente a la distribución de cargas y así alterar llamativamente el comportamiento y la conformación de las proteínas con alteraciones intrínsecas. Las regiones con alteraciones intrínsecas generalmente se unen a otras moléculas con una especificidad elevada. A menudo también tienen una afinidad de unión relativamente baja y se separan con relativa rapidez. Muchas regiones con alteraciones intrínsecas tienen suficiente flexibilidad para unirse a varias moléculas diferentes. Un ejemplo de una región de una proteína con alteraciones intrínsecas es la secuencia de 51 residuos del extremo C-terminal de HIF-1α. Algunos de los aminoácidos de esta región adoptan una estructura α-helicoidal solo cuando están unidos a coactivadores de la transcripción en el núcleo (la función de HIF-1α se describe en la sección 1.4 y la fig. 16.5). La amilina, sintetizada por las células β pancreáticas, es otro ejemplo de un péptido que tiene una región alterada intrínsecamente (v. sección 8.4).

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6. Plegado de las proteínas Las proteínas se pliegan poco después de su síntesis, a veces con ayuda de chaperonas. Se forman enlaces disulfuro con la ayuda de una enzima. El esqueleto de una proteína puede, en teoría, adoptar un inmenso número de conformaciones diferentes, aun cuando los enlaces peptídicos pueden adoptar tan solo un número escaso de ángulos de torsión (v. sección 2.1). Durante la síntesis y después, una proteína tiende a adoptar una conformación de baja energía, que habitualmente es una conformación con una baja cantidad de movimiento interno (es decir, una situación de empaquetamiento denso). Sin embargo, algunas proteínas nativas no están en su estado de menor energía; el estado de menor energía puede ser un estado de agregación, al que las proteínas normalmente no tienen acceso cinético. Parece probable que los elementos en bruto de una estructura secundaria se formen justo después de la síntesis de la proteína, y que algunos residuos de aminoácidos clave formen contactos con otros residuos para que la cadena polipeptídica adopte rápidamente una estructura tridimensional que es aproximadamente similar a su estado nativo. Entonces, la proteína puede organizarse en su estructura nativa compacta final; las láminas y hélices, además de las interacciones entre residuos de aminoácidos alejados en la secuencia primaria, se hacen más apretadas. En este punto, las interacciones electrostáticas y de Van der Waals, que dependen claramente de la conformación tridimensional de una proteína, transmiten especificidad a una conformación particular de la proteína. Se cree que en las proteínas grandes los dominios primero se pliegan y después interactúan. La estructura nativa de las proteínas tiene una estabilidad tan solo marginal. De hecho, habitualmente se observa que las proteínas mutantes tienen una vida más corta que las proteínas normales; parte de esta reducción de la vida se puede atribuir a una menor estabilidad. Algunas proteínas no se pliegan para adquirir su forma correcta por sí solas, sino que dependen de proteínas chaperonas que utilizan energía procedente de la hidrólisis del ATP para guiar las proteínas hacia el patrón de plegado correcto. Algunas chaperonas detectan proteínas no plegadas o con plegado incorrecto gracias a parches expuestos de cadenas laterales de aminoácidos hidrófobos. Como se describe en el capítulo 7, las proteínas chaperonas vuelven a plegar las proteínas con plegado anómalo o las llevan a su degradación en los proteosomas. Cuando se despliegan artificialmente in vitro proteínas pequeñas que normalmente no necesitan chaperonas para el plegado, a menudo se vuelven a plegar en menos de 1 segundo. Los miembros de la familia de proteínas disulfuro isomerasa catalizan la formación de enlaces disulfuro entre cadenas laterales de cisteína.

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7. Desnaturalización de las proteínas Las proteínas se desnaturalizan intencionadamente como parte de la desinfección. La desnaturalización de una proteína se define como la pérdida de su estructura tridimensional nativa (fisiológica). Sin embargo, una proteína desnaturalizada puede seguir conservando alguna estructura secundaria, como hélices α o láminas β. Una vez que se ha desnaturalizado una proteína in vitro, a menudo no se puede volver a plegar hasta su estructura nativa original. Los posibles motivos de este fenómeno son que la proteína originalmente empezó a plegarse ya durante la biosíntesis, de manera que los residuos del extremo N-terminal se pudieron plegar antes de que pudieran interferir los residuos del extremo C-terminal; que la proteína se plegara con ayuda de chaperonas, y que la proteína experimentara un procesado proteolítico postraduccional u otro tipo de procesado después del proceso de plegado normal. Para la mayor parte de las proteínas, la diferencia de energía libre entre el estado fisiológico normal y el estado desnaturalizado es del orden de tan solo ∼10 kcal/mol. Esta cantidad de energía es aproximadamente equivalente a la formación de novo de dos enlaces de hidrógeno o a la ocultación de dos cadenas laterales de fenilalanina en el interior de la proteína en lugar de exponerlas por completo al agua. Las chaperonas pueden desplegar las proteínas dentro de las células para su transporte de un compartimento a otro (p. ej., del citosol al núcleo, o del citosol a las mitocondrias a través de poros especializados en las membranas de estos orgánulos). La desnaturalización de las proteínas a menudo se utiliza como método de desinfección. Una temperatura excesivamente alta y no fisiológica, como en la pasteurización, el cocinado y la esterilización, lleva a la pérdida de la conformación normal de las proteínas. Esto se debe en gran parte al aumento de la entropía inducido por la temperatura, que desestabiliza los enlaces de hidrógeno, las interacciones hidrófobas, las interacciones electrostáticas y las fuerzas de Van der Waals. Un cambio del pH también puede causar desnaturalización. Esto sucede fisiológicamente en los lisosomas y endosomas de todas las células, así como en la luz del estómago. En una situación patológica, por ejemplo, sucede cuando los ojos están expuestos a sosa cáustica (NaOH concentrado). Los desinfectantes que contienen yodo (p. ej., povidona yodada; los denominados yodóforos) yodan las proteínas. Los alcoholes (p. ej., etanol o isopropanol al 70-90%), que sustituyen al agua como disolvente, causan disminución de los enlaces de hidrógeno entre la proteína y el disolvente, reducción de los efectos hidrófobos y disminución de la protección de las cargas eléctricas por el disolvente. La lejía y otros desinfectantes similares liberan ácido hipocloroso e

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hipoclorito (HOCl y ClO−, respectivamente), que cloran el carbono α de los aminoácidos. Las «alternativas a la lejía» liberan ácido hipocloroso e hipoclorito a un pH algo ácido en lugar del pH intensamente alcalino de la lejía normal (p. ej., hipoclorito sódico). Los detergentes pueden solubilizar las cadenas laterales hidrófobas y así alterar la conformación de una proteína.

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8. Enfermedades que se acompañan por una agregación excesiva de proteínas La agregación patológica de las proteínas en estructuras fibrilares es un dato fundamental de enfermedades degenerativas como las enfermedades de Alzheimer y Parkinson. El aumento de la formación de enlaces de hidrógeno y el secuestro de los residuos hidrófobos alejándolos del agua llevan a la agregación de las proteínas para formar fibrillas.

8.1. Formación de fibrillas de amiloide extracelulares Las fibrillas de amiloide son agregados fibrilares de proteínas que se tiñen con rojo Congo. El término amiloide es en parte erróneo. En el siglo XIX, Virchow encontró que podía teñir estas fibras con yodo, igual que el almidón, y las denominó fibras de amiloide (en griego ámylon significa almidón). Poco después de eso quedó claro que las fibras de amiloide no solo contienen hidratos de carbono, sino también proteínas. Las fibrillas de amiloide tienen aproximadamente 100 Å (10 nm) de diámetro y una longitud de hasta más de 100 veces su diámetro (es decir, una longitud de hasta ≥1 µm; a modo de comparación, un eritrocito tiene un diámetro de 7–8 µm). Las fibrillas pueden contener miles de moléculas de proteína. Las fibrillas de amiloide se forman como consecuencia de un aumento patológico de la concentración de una o más proteínas normales, por la presencia de una proteína mutante, la presencia de una estructura germen o la ausencia de un inhibidor de la agregación. Todas las fibrillas de amiloide contienen cadenas β y láminas β en un motivo cruzado β. Las láminas β y el motivo cruzado β se extienden por toda la longitud de la fibrilla. La dirección de las cadenas β de las moléculas individuales es perpendicular a la longitud de la fibrilla. La figura 9.9 muestra un ejemplo de una fibrilla de amiloide. Las fibrillas de amiloide pueden servir como gérmenes iniciadores a los que se añaden moléculas adicionales, de modo que toda la fibrilla tiene la misma arquitectura longitudinal. Un único tipo de péptido puede dar lugar frecuentemente a varias estructuras de fibrillas de amiloide diferentes.

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FIG. 9.9 Modelo de fibrillas Aβ40 cultivadas in vitro utilizando como puntos iniciadores muestras del encéfalo de un paciente con enfermedad de Alzheimer. El eje largo de la fibrilla es paralelo a la línea de visión. La fibrilla es similar a una pila de tortillas, cada una de las cuales está formada por tres moléculas de Aβ40 (azul claro, verde o magenta) estabilizadas principalmente por los efectos hidrófobos debidos a las cadenas laterales de aminoácidos no polares. La pila, a su vez, es estabilizada principalmente por enlaces de hidrógeno entre los átomos del esqueleto de moléculas sucesivas. (De Tycko R. Amyloid polymorphism: structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 2015;6(8):632-645.)

La formación de las fibrillas de amiloide es favorable para muchas proteínas desde el punto de vista energético, aunque otros estados de baja energía, así como barreras cinéticas, pueden impedir que las proteínas se incorporen al amiloide. Se sabe que unas 25 proteínas diferentes dan lugar a fibrillas de amiloide in vivo, y los núcleos peptídicos de todas estas fibrillas poseen otras moléculas diferentes (p. ej., el proteoglucano de heparán sulfato, apolipoproteína E y amiloide P sérico). El proteoglucano de heparán sulfato es una parte normal de la matriz extracelular (v. cap. 13); los grupos sulfato y carboxilo con carga negativa de sus cadenas de hidrato de carbono se unen a las cadenas laterales de aminoácidos con carga positiva (p. ej., Arg, Lys o His) de varias moléculas de proteína de la fibrilla. La apolipoproteína E es un componente de muchas partículas de lipoproteínas (v. caps. 28 y 29). La proteína del amiloide P sérico es una glucoproteína sintetizada en el hígado, segregada hacia la sangre y finalmente eliminada por el hígado. Su semivida en el suero es de ∼1 día. Durante la inflamación, la concentración de amiloide P en el suero aumenta hasta 1.000 veces. No se conoce con detalle la función fisiológica normal del amiloide P sérico. El amiloide P sérico pertenece a la familia de la pentraxina. Esta familia de proteínas interviene en la opsonización y la neutralización de patógenos como parte del sistema inmunitario innato, que después informa al sistema inmunitario adaptativo. La proteína del amiloide P sérico puede estabilizar las fibrillas uniéndose simultáneamente a los monosacáridos de varias moléculas de la proteína amiloidógena glucosilada. Las fibrillas de amiloide son insolubles en agua, y las proteasas extracelulares y las células fagocíticas no las degradan de manera apreciable. La formación de fibrillas de amiloide se asocia a deterioro funcional y muerte de las células vecinas, aunque se conoce mal la patogenia exacta. Las propias fibrillas de amiloide, u oligómeros de mucho menor tamaño de sus componentes, alteran la función celular, tal vez modificando la permeabilidad de la membrana celular. Además, una cantidad cada vez mayor de amiloide extracelular puede desplazar las células y finalmente reducir el aporte de nutrientes. Las localizaciones habituales del depósito de amiloide y la muerte celular son el encéfalo, el corazón, el riñón y las articulaciones. Cuando se sospecha que los pacientes tienen una enfermedad por amiloide (v. a continuación), el diagnóstico definitivo a menudo depende de mostrar la presencia de placas de fibrillas de amiloide largas y no ramificadas utilizando colorantes y microscopia óptica, además de microscopia

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electrónica. Para ello, el material de biopsia puede proceder de tejido gingival, grasa subcutánea abdominal o tejido renal. Si la enfermedad por amiloide afecta exclusivamente al encéfalo, este análisis habitualmente se realiza después de la muerte del paciente. Actualmente las fibras de amiloide se identifican por su aspecto (placas en microscopia óptica, fibrillas de ∼10 nm de diámetro en microscopia electrónica y una longitud del orden de µm independientemente de la proteína del núcleo) y la tinción con rojo Congo («congofilia»; si se tiñe con este colorante, aparece de color rojo o verde con microscopia de luz polarizada cuando el plano de la luz polarizada es paralelo o perpendicular al eje longitudinal de la fibrilla, respectivamente, lo que se debe a la orientación de las láminas β repetitivas en la fibrilla). Se pueden utilizar antisueros para determinar la proteína que da lugar a las fibrillas de amiloide. Otra opción útil es la microdisección láser de las placas en una biopsia, seguida por espectrometría de masas.

8.2. Formación de agregados intracelulares Se sabe que se forman agregados intracelulares por varios mecanismos que van de efectos hidrófobos a formación de láminas β cruzadas. En pacientes con enfermedad drepanocítica se forman fibras en el interior de los eritrocitos por la agregación de la hemoglobina S (puede verse una discusión detallada en la sección 3.2 del cap. 17 y en las figs. 17.5 y 17.6). Mediante la formación de una estructura cruzada β, las proteínas normales pueden dar lugar a ovillos neurofibrilares, fibrillas de amiloide o inclusiones intranucleares. La agregación está dirigida por las mismas fuerzas básicas que la agregación extracelular (v. sección 8.1). Los ovillos neurofibrilares de los pacientes con enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal familiar con parkinsonismo, síndrome de Down o esclerosis lateral amiotrófica contienen proteína tau agregada, fosforilada de forma anómala y acetilada. Tau es una proteína asociada a los microtúbulos que los estabiliza. Los microtúbulos son estructuras similares a cables en el interior de las células, y sobre ellos «viajan» las proteínas motoras, que desplazan los orgánulos intracelulares, así como los cromosomas y las cromátidas, durante la meiosis y la mitosis. Se cree que la agregación de tau causa carencia de tau libre, lo que hace que los microtúbulos sean menos estables y así altera el transporte a lo largo de los axones, de manera que las neuronas ya no funcionan correctamente. Tauopatía es el término que se utiliza para las enfermedades que se acompañan por formación de fibrillas que contienen tau.

8.3. Enfermedad de Alzheimer Las fibrillas de amiloide extracelulares que se ven en la enfermedad de Alzheimer y en el síndrome de Down están formadas por los residuos de aminoácidos 1-40 y 1-42 de la proteína Aβ. Estos polipéptidos derivan de la

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proteína precursora del amiloide (APP) por la acción de las secretasas β y γ (estas secretasas son proteasas). La proteína Aβ se encuentra en todo el cuerpo, aunque las fibrillas de Aβ están restringidas a las sinapsis y las membranas basales de los vasos sanguíneos del encéfalo. Las principales formas hereditarias de enfermedad de Alzheimer están causadas por mutaciones en los genes de APP, presenilina 1 y presenilina 2. Las mutaciones del gen APP habitualmente afectan a aminoácidos del exterior de la proteína Aβ (1-42) pero adyacentes a los sitios de escisión por las secretasas. Las mutaciones en las presenilinas alteran la actividad de la secretasa γ. El gen de APP está en el cromosoma 21, y los pacientes con síndrome de Down tienen tres copias del cromosoma 21. Los pacientes con síndrome de Down tienen depósitos de amiloide a los 40 años de edad. Para los estudios de investigación se puede evaluar la cantidad de amiloide Aβ en el encéfalo mediante tomografía por emisión de positrones (PET) utilizando un colorante radiactivo (marcado con 18F). Los pacientes con la isoforma de la apolipoproteína E4 tienen más probabilidad de tener enfermedad de Alzheimer esporádica. En comparación con los homocigotos para el alelo E3 (∼60% de la población), cada alelo E4 duplica aproximadamente el riesgo y causa el inicio aproximadamente 5 años antes. El alelo de la apolipoproteína E4 es el principal factor de riesgo de enfermedad de Alzheimer esporádica. En Estados Unidos, el ∼2% de la población es homocigoto para el alelo E4, y el ∼20% es heterocigoto. Aparte de las fibrillas extracelulares formadas por Aβ (fig. 9.10), la mayor parte de los pacientes con enfermedad de Alzheimer también tienen fibrillas intracelulares formadas por tau, y también otras fibrillas intracelulares compuestas de sinucleína α (cuerpos de Lewy; v. enfermedad de Parkinson en la sección 8.5). La proteína tau de las fibrillas intracelulares tiene una fosforilación y una acetilación aberrantes y no puede desempeñar su función normal en la estabilización de los microtúbulos.

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FIG. 9.10

Placas extracelulares que contienen amiloide β en el encéfalo de un paciente con enfermedad de Alzheimer.

8.4. Diabetes tipo 2 En muchos pacientes que tienen diabetes tipo 2 o un insulinoma se forman fibrillas patológicas de amilina predominantemente en el espacio extracelular de los islotes de Langerhans del páncreas. La amilina es una hormona peptídica de 37 aminoácidos que es un péptido alterado intrínsecamente de forma parcial (v. sección 5). También se denomina polipéptido amiloideo insular (IAPP). La amilina interviene en la regulación del metabolismo de la glucosa (v. caps. 26 y 39). Junto con la insulina, la amilina se almacena dentro de las vesículas secretoras de las células β y, por ello, también se segrega con la insulina. En el interior de las vesículas secretoras de las células β, la insulina (pero no la proinsulina) se une a la amilina y de esta manera impide que la amilina se agregue y forme fibrillas. En el interior de las vesículas secretoras hay ∼100 moléculas de insulina por cada molécula de amilina. En el torrente circulatorio, la concentración de amilina es demasiado baja como para poder agregarse de forma apreciable y formar fibrillas. Por lo tanto, la agregación está confinada al espacio extracelular próximo a las células β. Parece probable que los oligómeros de amilina sean patógenos, interactúen con la membrana plasmática y tal vez alteren la permeabilidad de la membrana, lo que lleva a la muerte de las células β. Aún queda por verse si este mecanismo es responsable de parte del deterioro de la función de las células β que es característico de la diabetes tipo 2. Igual que otras fibrillas de

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amiloide, las fibrillas de amilina contienen una estructura cruzada β. La pramlintida es un análogo sintético y especialmente soluble de la amilina que se utiliza para tratar a pacientes con diabetes tipo 1 o tipo 2 (v. cap. 39). La pramlintida reduce mucho las oscilaciones de la glucemia después de una comida; de hecho, cuando los pacientes toman pramlintida necesitan menos insulina para controlar la glucemia.

8.5. Enfermedad de Parkinson La enfermedad de Parkinson puede originarse como consecuencia de diversas mutaciones genéticas. Mediante mecanismos que son en gran medida desconocidos, muchos pacientes acumulan fibrillas (también denominadas cuerpos de Lewy; fig. 9.11) en el interior de las células de la sustancia negra. Las fibrillas contienen principalmente sinucleína α, una proteína que se sintetiza en las sinapsis. La enfermedad se acompaña por pérdida de neuronas en la sustancia negra. La sustancia negra normalmente envía mensajes a los ganglios basales a través de sinapsis dopaminérgicas.

FIG. 9.11

Agregación patológica de sinucleína α en la enfermedad de Parkinson.

Los pacientes con enfermedad de Parkinson tienen temblor en reposo, pero no durante los movimientos voluntarios. También tienen rigidez muscular, se mueven lentamente y tienen poca expresividad facial. La enfermedad de Parkinson habitualmente se manifiesta clínicamente entre la sexta y la octava década de la vida. En Estados Unidos, más del 2% de la población tiene enfermedad de Parkinson. La mayor parte de los casos de esta enfermedad son esporádicos. Algunas de las formas hereditarias de enfermedad de Parkinson se deben a mutaciones de sentido equivocado en la sinucleína α.

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Resumen ■ Las proteínas se sintetizan a partir de 21 aminoácidos diferentes, que están unidos entre sí por enlaces peptídicos (–CO–NH–). La disposición espacial de estos aminoácidos determina las propiedades de una proteína. ■ De promedio, en el estado plegado natural, aproximadamente dos tercios de los residuos de aminoácidos de una proteína forman parte de hélices α o de láminas β. Los aminoácidos que no forman parte de las hélices y láminas generalmente forman parte de giros y bucles. Los giros cerrados tienen una estructura común, pero las regiones de bucle más largas habitualmente difieren mucho en estructura de unas proteínas a otras. ■ La estructura tridimensional natural o nativa de las proteínas es la consecuencia de los enlaces de H, los efectos hidrófobos, las interacciones electrostáticas y las interacciones de Van der Waals entre los átomos de los aminoácidos. ■ La termodinámica favorece la agregación de las cadenas β para dar láminas β infinitamente grandes. En la naturaleza habitualmente se impide esta agregación, generalmente mediante mecanismos estéricos. Sin embargo, hay muchas enfermedades, denominadas colectivamente enfermedades por amiloide, que se asocian a agregación de proteínas en fibrillas muy largas de ∼10 nm de diámetro llamadas fibrillas de amiloide. Los pacientes con enfermedad de Alzheimer muestran fibrillas de amiloide extracelulares que contienen la proteína Aβ; estas fibrillas, a su vez, dan lugar a placas. Las neuronas de los pacientes con enfermedad de Alzheimer también contienen fibrillas intracelulares de proteína tau, que forman ovillos neurofibrilares. Las fibrillas extracelulares que contienen amilina (también denominada IAPP) se encuentran en pacientes con diabetes tipo 2. En pacientes con enfermedad de Parkinson, la sinucleína α da lugar a fibrillas intracelulares en las células de la sustancia negra; las fibrillas se agregan para formar cuerpos de Lewy.

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Lecturas recomendadas ■ Finkelstein AV, Ptitsyn OB. Protein Physics: A Course of Lectures, ed 2. London: Academic Press; 2016:528. Estos autores utilizan un riguroso enfoque químico, adecuado para quienes quieran saber más sobre las estructuras de las proteínas. ■ Protein Data Bank: . Esta base de datos da acceso libre a información sobre miles de estructuras de proteínas. ■ Tycko R. Amyloid polymorphism: structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 2015;86:632–645.

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CAPÍTULO 10

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Enzimas y consecuencias de las carencias enzimáticas Sinopsis ■ Las enzimas catalizan reacciones químicas reduciendo las energías de activación de estas reacciones. ■ La mayor parte de las enzimas son proteínas, aunque algunas están formadas por ARN o una mezcla de ARN y proteína. Algunas enzimas necesitan coenzimas (moléculas orgánicas no proteínicas) para la catálisis. ■ La termodinámica determina si una reacción de reaccionantes a productos es posible desde el punto de vista energético. ■ Los cambios fisiológicos y patológicos de las concentraciones de los reaccionantes y los productos permiten que muchas reacciones del cuerpo humano cambien de dirección; se dice que estas reacciones son reversibles. Otras reacciones son favorables únicamente en una dirección en condiciones compatibles con la vida; estas relaciones se denominan fisiológicamente irreversibles. ■ Hay circuitos reguladores que controlan las actividades de muchas de las enzimas que catalizan reacciones fisiológicamente irreversibles. ■ La disposición tridimensional de los aminoácidos en las enzimas aporta especificidad a la unión de los sustratos. ■ La ecuación de Michaelis-Menten describe la manera en la que la actividad enzimática depende de la concentración de los sustratos. Esta ecuación es válida para algunas enzimas. ■ Algunas enzimas muestran cooperatividad y, en consecuencia, se las describe con una ecuación de Michaelis-Menten modificada. Estas enzimas tienen una actividad significativa solo por encima de una concentración liminar del sustrato. ■ La actividad de determinadas enzimas es regulada por activadores, inhibidores y/o modificación covalente, como la fosforilación. ■ En todas las rutas, la enzima con la menor velocidad de reacción limita el flujo por la ruta. Una carencia enzimática tiende a incrementar la concentración de todos los reaccionantes en sentido proximal y a reducir la concentración de todos los productos en sentido distal.

Objetivos de aprendizaje 299

Para dominar este tema, debería ser capaz de hacer lo siguiente: ■ Examinar los recursos disponibles para determinar si dos enzimas catalizan la misma reacción o reacciones diferentes. ■ Definir los términos zimógeno, proenzima, ribozima, coenzima, cofactor, grupo prostético, apoenzima, holoenzima, isozima, ciclo catalítico y unidad enzimática. ■ Describir la relación entre la termodinámica y la posibilidad de que una enzima catalice una reacción química. ■ Explicar cómo una enzima puede incrementar la velocidad de una reacción. ■ Comparar y contrastar las reacciones fisiológicamente reversibles e irreversibles en el cuerpo humano. ■ Explicar el efecto de la temperatura y el pH sobre una reacción catalizada por una enzima. ■ Comparar y contrastar la teoría de llave y cerradura y la teoría del ajuste inducido de la acción enzimática. ■ Utilizar la ecuación de Michaelis-Menten para relacionar la Km, la actividad enzimática y la concentración de los sustratos. ■ Comparar y contrastar las propiedades de las enzimas que muestran una cinética tipo Michaelis-Menten simple con las de las enzimas que muestran cooperatividad. ■ Definir el alosterismo y presentar un ejemplo. ■ Comparar y contrastar la forma en que los inhibidores competitivos y no competitivos afectan a la velocidad de la catálisis enzimática, teniendo en consideración la concentración del sustrato. ■ Indicar un ejemplo de regulación por retroalimentación (feedback) y por proalimentación (feed-forward). ■ Predecir los efectos de la carencia parcial o completa de una enzima sobre las concentraciones de los intermediarios de una ruta metabólica. ■ Explicar por qué la actividad de algunas enzimas en la sangre tiene interés para el diagnóstico de enfermedades.

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1. Nomenclatura de las enzimas Los nombres de las enzimas acaban en -asa. Hay diferentes sistemas para su denominación; en este texto se utilizan los «nombres recomendados». La mayor parte de las enzimas son proteínas y en ocasiones requieren cofactores inorgánicos u orgánicos, no peptídicos, para la catálisis. Algunas enzimas están formadas por ARN o una mezcla de ARN y proteína. Las enzimas se caracterizan por el sufijo –asa. Cada enzima se puede identificar de tres maneras diferentes: 1) el nombre recomendado, que generalmente es el nombre asignado históricamente (p. ej., hexocinasa; tabla 10.1); 2) el «nombre sistemático», que describe la función química de una enzima (p. ej., ATP:D-hexosa-6-fosfotransferasa; tabla 10.2), y 3) el número de clasificación de la enzima (p. ej., EC 2.7.1.1), que se basa en el sistema de denominación sistemático. Este texto generalmente utiliza solo los nombres recomendados, aunque estos nombres a veces contrastan con la función fisiológica de una enzima. En el caso de los nombres recomendados, algunas enzimas reciben su nombre del compuesto que degradan (p. ej., glucosa6-fosfatasa, que degrada la glucosa-6-fosfato a glucosa y fosfato; v. caps. 24 y 25). Otras reciben un nombre más descriptivo por la reacción que catalizan (p. ej., alcohol deshidrogenasa, que elimina hidrógeno de un alcohol [v. cap. 30], o aminotransferasa, que transfiere un grupo amino de un aminoácido a un cetoácido [v. cap. 35]). Algunas enzimas reciben su nombre de las reacciones que catalizan en el tubo de ensayo, pero no en el cuerpo humano.

Tabla 10.1 Clasificación de las enzimas por nombre recomendado

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* Las reacciones se escriben en la dirección que corresponde al nombre recomendado. Se muestra que las

reacciones son reversibles (↔) porque las enzimas actúan en ambas direcciones. Las concentraciones de los reaccionantes y productos afectan a la dirección de la reacción. AMPc, adenosina monofosfato cíclico; ATP, adenosina trifosfato; HMG-CoA, 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A.

Tabla 10.2 Clasificación de las enzimas por nombre sistemático

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EC, número en la clasificación de las enzimas; UDP, uridina difosfato.

Prácticamente todas las enzimas son proteínas. Sin embargo, un pequeño número de ARN también puede catalizar reacciones químicas. Este grupo de ARN se llaman ribozimas, enzimas de ARN o ARN catalíticos. Las ribozimas importantes desde el punto de vista fisiológico generalmente catalizan reacciones en las que participa el ARN como sustrato (p. ej., procesado del ARN por ayustosomas [v. cap. 6] o síntesis de proteínas por los ribosomas [v. sección 3 en cap. 7]). Salvo que se especifique lo contrario, en este capítulo el término enzima se refiere a una proteína. Un zimógeno o proenzima es una proteína precursora de una enzima activa que tiene una actividad enzimática escasa o nula; sin embargo, una vez que ha sufrido procesado postraduccional, muchas veces mediante proteólisis limitada, pasa a ser competente para la catálisis. Por ejemplo, el páncreas segrega tripsinógeno, quimotripsinógeno y proelastasa, inactivos desde el punto de vista enzimático, que se transforman en las enzimas activas tripsina, quimotripsina y elastasa, respectivamente, en la luz del intestino (v. cap. 34). Una coenzima es una molécula orgánica que se une a una enzima (de forma transitoria o permanente) y participa en la catálisis. Las coenzimas habitualmente son necesarias para reacciones de oxidación-reducción y como aceptadores temporales en la transferencia de grupos químicos. Un ejemplo es el ácido lipoico, que interviene en la descarboxilación oxidativa del piruvato por la piruvato deshidrogenasa (v. cap. 22). El ácido lipoico está unido covalentemente al grupo amino de la cadena lateral de un residuo de

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lisina de la piruvato deshidrogenasa. El ácido lipoico acepta transitoriamente un grupo CH3–CH(OH)–, lo presenta para su oxidación a CH3–CO– y transfiere CH3–CO– a otra coenzima, la coenzima A. Muchas enzimas contienen iones metálicos estrechamente unidos en sus sitios activos; estos iones metálicos habitualmente no se llaman coenzimas. Algunos términos en enzimología están mal definidos y, en consecuencia, se utilizan de diferentes maneras. Así, las coenzimas a menudo también se denominan cofactores. A veces la distinción entre sustrato y coenzima es difusa. Por ejemplo, NAD+ y NADH son sustratos de muchas deshidrogenasas diferentes, pero algunos científicos también se refieren a ellos como coenzimas o cofactores. Algunas coenzimas se llaman grupos prostéticos. En general, el término grupo prostético implica que la enzima está unida con fuerza o covalentemente a la enzima y no se disocia de ella durante la catálisis. Un ejemplo de un grupo prostético de este tipo es la biotina, que está unida covalentemente a un residuo de lisina en todas las carboxilasas humanas (v. sección 3 en cap. 22 y sección 2 en cap. 27). Otros ejemplos son el ácido lipoico (que se ha mencionado en el párrafo anterior) y el hemo en los citocromos (v. caps. 14 y 23). El término apoenzima se refiere a una enzima dependiente de una coenzima que no tiene unida la coenzima, mientras que el término holoenzima se refiere a esa enzima que tiene unida su coenzima, habitualmente de forma estrecha. Una holoenzima también puede ser un conjunto enzimáticamente activo formado por una o más moléculas. Las isozimas (isoenzimas) son enzimas que catalizan la misma reacción, aunque difieren en sus secuencias de aminoácidos. A menudo las enzimas difieren en su máxima velocidad de catálisis (es decir, Vmáx, v. sección 3) y en la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la actividad semimáxima (es decir, Km o S0,5; v. sección 3). Un ejemplo son las hexocinasas, que fosforilan la glucosa. Las hexocinasas I, II, III y IV tienen una actividad semimáxima a concentraciones de glucosa de aproximadamente 0,03, 0,3, 0,03 y 5 mM, respectivamente. Algunas isoenzimas derivan de genes diferentes; otras se originan en un único gen por el uso de sitios alternativos de inicio de la transcripción, ayuste alternativo del ARN o procesado postraduccional diferente (v. caps. 6 y 7).

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2. Catálisis enzimática de reacciones químicas La elevada especificidad observada en la unión de los sustratos a las enzimas se debe a efectos estéricos y a las interacciones de numerosos grupos funcionales entre enzimas y sustratos. Una reacción catalizada por una enzima es más rápida que una reacción no catalizada porque tiene menor energía de activación. La temperatura y el pH influyen profundamente en la actividad de las enzimas. La termodinámica química permite determinar si puede tener lugar una reacción química, basándose en el análisis de la temperatura, la concentración y la energía libre estándar de Gibbs (G0) de los reaccionantes y los productos. Solo se producen espontáneamente las reacciones que llevan a una reducción total de la energía libre de Gibbs (las que tienen un ∆G negativo). El cambio de la energía libre de Gibbs durante una reacción (∆G) depende del estado energético de los átomos y los enlaces entre ellos, el movimiento de los átomos y las moléculas en el espacio (p. ej., rotación, vibración y oscilación), y las concentraciones de los reaccionantes y productos. Solo se pueden producir espontáneamente las reacciones que conllevan una reducción de la energía libre de Gibbs; las enzimas no modifican este hecho. Cuando una reacción química está en equilibrio, no hay ninguna fuerza neta que la impulse hacia los reaccionantes o los productos. Por lo tanto, en equilibrio la fuerza impulsora termodinámica ∆G es cero. En las células habitualmente hay cierto flujo en todas las rutas metabólicas; por lo tanto, prácticamente ninguna reacción está exactamente en equilibrio. Sin embargo, muchas reacciones están cerca del equilibrio. Los ejemplos de estas reacciones son la isomerización de la glucosa-6-fosfato y la fructosa-6-fosfato en la glucólisis (v. cap. 19) y la gluconeogénesis (v. cap. 25), además de la reacción de oxidorreducción entre malato y oxalacetato en el ciclo del ácido cítrico (v. cap. 22). Una enzima acelera la velocidad de una reacción posible desde el punto de vista termodinámico reduciendo la energía de activación de la reacción. Muchas reacciones posibles desde el punto de vista termodinámico no suceden porque su energía de activación es demasiado elevada. Por ejemplo, la glucosa y el ATP en agua a pH 7 no reaccionan apreciablemente entre sí. Sin embargo, la enzima hexocinasa modifica la ruta de la reacción de manera que la energía de activación es suficientemente baja para que se produzca la reacción con una frecuencia elevada a la temperatura corporal normal. La energía de activación de una reacción depende principalmente del nivel energético del estado de transición que tiene la mayor energía libre de Gibbs. Por lo tanto, la energía de activación también se denomina barrera al estado de transición (fig. 10.1). Como las enzimas afectan solo a la ruta de la reacción, pero no a la naturaleza de los reaccionantes ni de los productos, las

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enzimas no afectan a la posición del equilibrio entre reaccionantes y productos.

FIG. 10.1

Efecto de una enzima sobre el diagrama energético de una reacción química. Se representa la media de la energía libre de Gibbs de los productos intermedios de la ruta de la reacción (la energía térmica de las moléculas individuales varía algo alrededor de la media).

La temperatura afecta a las enzimas de dos maneras contrapuestas. Un aumento de la temperatura facilita la reacción al incrementar el número de moléculas que tienen suficiente energía para atravesar la barrera al estado de transición. Por otro lado, la mayor parte de las enzimas humanas pierden su estructura cuando aumenta la temperatura. El resultado neto es que la mayor parte de las enzimas tienen su máxima actividad cerca de la temperatura corporal central fisiológica. El pH afecta a la actividad enzimática al condicionar el grado de protonación de las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos terminales de los péptidos; esto, a su vez, influye en la formación de enlaces de hidrógeno y en las interacciones electrostáticas. Muchas veces la protonación de los residuos próximos al sitio catalítico es el principal factor que determina el valor óptimo de pH de una enzima. Estos residuos pueden actuar como donantes o aceptadores de protones. El pH también puede afectar a la protonación del sustrato. Las enzimas tienden a tener la máxima actividad al pH al que normalmente deberían ser activas. Para muchas enzimas que normalmente residen en la luz del intestino, la sangre, el espacio extracelular, el citosol, el retículo endoplasmático, las vesículas secretoras, las mitocondrias o el núcleo, el pH óptimo está en el intervalo de 7 a 8. Para muchas enzimas que deben ser activas en la luz del estómago o dentro de los lisosomas, el pH óptimo está en el intervalo de 4 a 5. Algunas de estas enzimas se inactivan cuando están expuestas a un pH próximo al neutro. Sin embargo, otras muchas enzimas son muy activas incluso lejos de su pH

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fisiológico normal. La mayor parte de las enzimas afectan solo a un conjunto estrecho de sustratos. La especificidad reside tanto en el sitio de unión al sustrato como en el mecanismo catalítico. Los sustratos se unen con una especificidad elevada en virtud de una red tridimensional de efectos electrostáticos, efectos hidrófobos, enlaces de hidrógeno e interacciones de Van der Waals, que ya se han descrito para las interacciones entre proteínas en la sección 3 del capítulo 9. Como las enzimas están formadas por L-aminoácidos, que son quirales, las propias enzimas son quirales (es decir, tienen lateralidad). De hecho, la mayor parte de las enzimas pueden distinguir los enantiómeros de los sustratos si el centro quiral del sustrato está próximo al sitio de unión del sustrato. Partiendo de la especificidad observada de las enzimas por los sustratos, la teoría de llave y cerradura de finales del siglo XIX postula que los sitios catalíticos de las enzimas encajan de forma precisa con los sustratos igual que un negativo encaja con su correspondiente positivo. Esta teoría puede explicar de hecho muchas interacciones entre enzimas, sustratos e inhibidores, aunque presenta las enzimas y los sustratos como estructuras estáticas e inflexibles. Partiendo de un conocimiento más completo de las estructuras químicas y las interacciones entre sustratos y enzimas, la teoría del ajuste inducido de mediados del siglo XX mejoró la teoría de llave y cerradura. Aquella asume de forma expresa que la estructura tridimensional de las enzimas y los sustratos no es rígida, sino flexible. La teoría del ajuste inducido postula que la unión de un sustrato puede inducir un cambio apreciable en la orientación de los grupos reactivos del sitio activo de una enzima, y que la catálisis muchas veces se produce solo cuando estos grupos reactivos tienen una orientación específica. La figura 10.2 muestra la estructura de una enzima que utiliza un mecanismo de ajuste inducido.

FIG. 10.2 Encaje inducido en la glucocinasa. En las células β pancreáticas secretoras de insulina, la glucocinasa actúa como sensor de glucosa (v. cap. 26). En el hígado, la glucocinasa produce glucosa-6fosfato principalmente en estado posprandial (v. cap. 19). Izquierda, glucocinasa pura. Derecha, glucocinasa con glucosa y un activador alostérico farmacológico.

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El dominio de mayor tamaño (azul) se muestra en la misma posición. Tras la unión a la glucosa, el dominio de menor tamaño (dorado) gira ∼100° en relación con el dominio de mayor tamaño, y el extremo de la hélice C-terminal (rojo) se aleja del dominio de mayor tamaño, de manera que la glucocinasa envuelve la glucosa en una cavidad. (Basado en los archivos de Protein Data Bank [www.rcsb.org] 1V4T y 1V4S de Kamata K, Mitsuya M, Nishimura T, Eiki J, Nagata Y. Structural basis for allosteric regulation of the monomeric allosteric enzyme human glucokinase. Structure. 2004;12:429-438.)

Las enzimas catalizan reacciones químicas ofreciendo una ruta de reacción que tiene una barrera al estado de transición menor que la reacción no catalizada y que, en consecuencia, se produce más fácilmente. Esto se puede conseguir mediante los mecanismos que se indican a continuación. Algunas enzimas inducen un cambio conformacional en un sustrato cuando se unen a él. Un cambio en la conformación de la enzima, que se induce con frecuencia por la unión de un sustrato, a veces lleva el sustrato y un cofactor a una alineación particularmente favorable. Otras enzimas se unen preferentemente a moléculas de sustrato que han adoptado una orientación y una configuración óptimas que favorecen la reacción y de esta manera reducen la barrera al estado de transición. Las enzimas facilitan la catálisis en una estructura tridimensional que aporta grupos químicos bien situados (incluyendo los de los cofactores), el movimiento de estos grupos químicos dependiente de la reacción o un espacio que puede estar libre de agua o que puede tener solo una o dos moléculas de agua situadas estratégicamente. En relación con esto último, la unión de un sustrato a veces induce el movimiento de un dominio de la enzima que envuelve el sustrato en una cavidad formada por aminoácidos que no tienen contacto con el agua. En muchas enzimas, los sustratos, los cofactores y los productos intermedios están unidos de tal manera que estabilizan el estado de transición. Las enzimas a veces están organizadas en complejos con sitios activos muy próximos entre sí (p. ej., carbamoilfosfato sintasa II/aspartato carbamoiltransferasa/dihidroorotasa en la síntesis de novo de los nucleótidos pirimidínicos; v. cap. 37) o con grupos prostéticos que hacen pasar los productos intermedios de un sitio activo a otro (p. ej., ácido graso sintasa; v. cap. 27). Estas disposiciones son favorables porque reducen la difusión, la degradación o la competición de los sustratos, además de aminorar la interacción de los sustratos con el líquido circundante. Las cadenas laterales de los aminoácidos de las enzimas pueden participar en la catálisis. Por ejemplo, Cys puede formar enlaces covalentes a través del átomo de azufre de su grupo sulfihidrilo, y Ser a través del átomo de oxígeno de su grupo hidroxilo. De manera similar, puede producirse protonación y desprotonación reversible de un átomo de nitrógeno del anillo de 5 miembros de His, de un átomo de oxígeno del grupo carboxilo de Asp o Glu, o del átomo de oxígeno del grupo hidroxilo de Ser (las estructuras de los aminoácidos se pueden ver en el cap. 9). Las enzimas difieren mucho en el tiempo que tardan en realizar un ciclo catalítico. Un ciclo catalítico comienza, por ejemplo, con la unión del sustrato

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y finaliza con la liberación del producto y la formación de la enzima en su estado inicial. Las propias proteínas G pueden tardar aproximadamente 7.000 s (∼2 horas) en completar un ciclo catalítico (hidrólisis de GTP a GDP; v. cap. 33). La glucocinasa necesita aproximadamente 0,02 s para fosforilar la glucosa a glucosa-6-fosfato (v. cap. 19), mientras que la fumarasa necesita tan solo aproximadamente 0,001 s para convertir fumarato + H2O en malato (v. cap. 22) y la anhidrasa carbónica necesita tan solo aproximadamente 0,000002 s para convertir CO2 + H2O en HCO3− + H+ (v. cap. 16). El número de recambio de una enzima (a menudo llamado kcat) es el número máximo de ciclos catalíticos que realiza una enzima en 1 s. Por ejemplo, si un ciclo catalítico tarda 0,001 s, el número de recambio es 1/0,001 s = 1.000 s−1.

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3. Actividad enzimática en función de la concentración de sustratos La ecuación de Michaelis-Menten describe la actividad de las enzimas simples en función de la concentración de sustrato. Una forma modificada de esta ecuación describe el comportamiento de las enzimas que muestran cooperatividad por un sustrato. La ecuación de Michaelis-Menten describe la actividad de una enzima en función de la concentración de un único sustrato. Esta ecuación es válida solo cuando la concentración del producto es despreciable y la concentración del complejo enzima-sustrato se mantiene constante.

En la ecuación anterior, v es la velocidad a la que la enzima da lugar al producto (moles/tiempo). Vmáx es la máxima velocidad a la que la enzima puede sintetizar un producto (se supone que sucede a una concentración infinitamente elevada del sustrato, aunque en la práctica hay límites a la concentración del sustrato, como la solubilidad del sustrato y los efectos de la solución sobre la estructura de la enzima). La concentración del sustrato se indica con s. Km es la concentración del sustrato a la cual la enzima da lugar al producto a la mitad de la velocidad máxima (es decir, v/Vmáx = 0,5). En la figura 10.3 se muestra un gráfico basado en valores que se ajustan a esta ecuación. Vmáx y Km son las propiedades características de las enzimas individuales.

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FIG. 10.3 Actividad de dos enzimas diferentes en función de la concentración del sustrato según lo predicho por la ecuación de MichaelisMenten.

Si una enzima tiene dos sustratos se sigue aplicando la ecuación de Michaelis-Menten cuando se mantiene constante la concentración de un sustrato y la otra varía. Además, el producto de v/Vmáx del sustrato 1 y v/Vmáx del sustrato 2 muchas veces es una aproximación útil de la velocidad de una reacción que tiene dos sustratos. Una ecuación de la misma forma matemática que la ecuación de MichaelisMenten también se aplica a la unión de moléculas a proteínas, como la unión de la insulina al receptor de insulina, o de la cobalamina al factor intrínseco. En estas ecuaciones la unión real sustituye a v, y la magnitud máxima de la unión sustituye a Vmáx. Ks, la concentración a la que la unión a la proteína es la mitad de la máxima, sustituye a Km, la concentración de sustrato a la que la enzima tiene la mitad de su actividad máxima. De acuerdo con la ecuación de Michaelis-Menten, la actividad enzimática no es directamente proporcional a la concentración del sustrato. En la tabla 10.3 se presentan algunos números fundamentales. (Debe tenerse en cuenta que si la concentración del sustrato es mucho menor que Km y menor que 0,01 × Km, la velocidad de la reacción v es casi proporcional a la

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concentración del sustrato s.) Tabla 10.3 Concentración del sustrato y actividad enzimática predicha por la ecuación de MichaelisMenten Concentración del sustrato

Actividad enzimática relativa (v/Vmáx)

0,1 × Km 1 × Km 10 × Km 100 × Km

0,09 0,50 0,91 0,99

En circunstancias fisiológicas la concentración del sustrato suele ser menor que la Km de una enzima. Por lo tanto, la mayor parte de las enzimas normalmente funcionan a solo una fracción de su capacidad catalítica máxima y, por ello, tienen mucha capacidad de reserva. Cuanto mayor sea la Km de una enzima por un sustrato, mayor será la concentración del sustrato que debe haber para alcanzar un determinado valor de v/Vmáx. La ecuación de Michaelis-Menten es válida independientemente de que el paso limitante de la velocidad en la catálisis enzimática sea la asociación entre la enzima y el sustrato o la reacción desde el complejo enzima-sustrato hasta el producto. En este último caso la Km es una medida de la afinidad por el sustrato de una enzima. La actividad enzimática habitualmente se describe en unidades enzimáticas (U). Una U es la cantidad de enzima que produce 1 µmol de producto por minuto. Las condiciones de esta actividad enzimática no están estandarizadas, sino que se deben definir en cada caso. En general, una unidad se refiere a una Vmáx medida. Algunas enzimas están formadas por varias unidades que interactúan y que tienen conformaciones mutuamente dependientes: la unión del sustrato a una subunidad induce un cambio de conformación en otra subunidad, lo que modifica sus propiedades catalíticas. Este fenómeno se denomina cooperatividad. La actividad de las enzimas que muestran cooperatividad por un sustrato se puede describir con una ecuación de Michaelis-Menten modificada como sigue:

En esta ecuación, S0,5 es la concentración de sustrato a la que la enzima

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muestra la mitad de la actividad máxima; se utiliza el término S0,5 en lugar de Km porque indica no la unión de una molécula de sustrato a la enzima y su reacción sino la media de la unión y la reacción de varias moléculas de sustrato. h es el coeficiente de Hill o coeficiente de cooperatividad. No tiene por qué ser un número entero. Si h es mayor que 1, se dice que la enzima tiene cooperatividad positiva. La representación lineal de la actividad de una enzima de este tipo en función de la concentración del sustrato muestra una relación con forma de S (fig. 10.4). (Aquí no se analiza la cooperatividad negativa.)

FIG. 10.4 Actividad enzimática prevista por una ecuación de MichaelisMenten modificada para enzimas que muestran cooperatividad por su sustrato. Sin cooperatividad: azul. Con cooperatividad: rojo.

Son ejemplos de enzimas que tienen cooperatividad la glucocinasa, que tiene un coeficiente de Hill de aproximadamente 1,5 (v. caps. 19 y 26) y la fosfofructocinasa 1 (v. cap. 19) y la amidofosforribosiltransferasa (v. cap. 38), que tienen coeficientes de Hill de aproximadamente 2. Hay una fórmula similar a la de la cooperatividad enzimática para la unión cooperativa de ligandos a proteínas en condiciones de equilibrio, como el

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oxígeno a la hemoglobina (saturación de hemoglobina con O2 = O2 unido a la hemoglobina/cantidad máxima de O2 unido a la hemoglobina = O2h/[O2h + P50h]; v. cap. 16). Una diferencia fisiológicamente importante entre una enzima que sigue la cinética de Michaelis-Menten y una que muestra cooperatividad es que esta última se puede inactivar más a concentraciones del sustrato menores que S0,5 (v. fig. 10.4).

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4. Activadores e inhibidores de las enzimas Los inhibidores y activadores de las enzimas tienen funciones importantes en la regulación fisiológica y farmacológica de las enzimas. Estos modificadores se unen al sitio activo de una enzima, un sitio regulador alejado del sitio activo, o cualquier otro lugar de la enzima. Los inhibidores competitivos compiten con el sustrato por su unión al sitio activo, mientras que los inhibidores no competitivos no muestran esta competición. Muchas enzimas son controladas por inhibidores y activadores que se unen reversiblemente. Un sustrato se une a un sitio al que se denomina, entre otros nombres, sitio de unión al sustrato, sitio activo o sitio catalítico. Los activadores habitualmente se unen a un lugar a cierta distancia del sitio de unión al sustrato; en este caso son activadores alostéricos (v. fig. 10.2 y tabla 10.4). Los inhibidores que compiten con el sustrato por un sitio de unión se denominan inhibidores competitivos. Los inhibidores que se unen a un sitio de unión a cierta distancia del sitio de unión al sustrato son inhibidores alostéricos. Algunos de estos inhibidores se denominan inhibidores no competitivos (también hay inhibidores mixtos y no competitivos, que no se analizan aquí). Los inhibidores no competitivos fisiológicos a menudo se unen a sitios reguladores específicos de las enzimas. Tabla 10.4 Ejemplos de activadores e inhibidores de enzimas frecuentes Tipo y subtipo

Ruta

Ejemplo

La fructosa-2,6-bisfosfato activa la fosfofructocinasa 1 aumentando su afinidad por el sustrato fructosa-6-fosfato (v. cap. 19) Síntesis de La glucosa-6-fosfato activa la glucógeno sintasa en parte incrementando glucógeno su afinidad por el sustrato UDP-glucosa (v. cap. 24) Señalización El AMPc activa la proteína cinasa dependiente de AMPc causando la disociación de las subunidades reguladoras que inhiben las subunidades catalíticas (v. cap. 33) Síntesis de El N-acetilglutamato induce una conformación activa de la urea carbamoilfosfato sintasa I, que cataliza uno de los primeros pasos en la eliminación del nitrógeno en forma de urea (v. cap. 35) INHIBIDORES REVERSIBLES Síntesis de Los fármacos de la clase de las estatinas, muy utilizados, inhiben la HMGInhibidor colesterol CoA reductasa uniéndose al sitio activo en lugar de la HMG-CoA (v. competitivo cap. 29) Síntesis de El fármaco antineoplásico metotrexato inhibe la dihidrofolato reductasa dTMP uniéndose al mismo sitio que el sustrato dihidrofolato (v. cap. 37) Glucólisis El ATP inhibe alostéricamente la fosfofrutocinasa 1 reduciendo su Inhibidor no afinidad por el sustrato fructosa-6-fosfato (v. cap. 19) competitivo Activador alostérico

Glucólisis

INHIBIDORES IRREVERSIBLES Síntesis de El cuerpo convierte el fármaco antineoplásico/quimioterápico 5Inhibidor dTMP fluorouracilo en 5F-dUMP, que reacciona en lugar del dUMP (es decir, suicida 5H-dUMP) con la timidilato sintasa y N5, N10-metilentetrahidrofolato, lo que lleva a un producto intermedio que no puede avanzar ni retroceder en la secuencia de reacciones (v. cap. 37) Formación La xantina oxidasa normalmente convierte la hipoxantina en xantina, y

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en la secuencia de reacciones (v. cap. 37) La xantina oxidasa normalmente convierte la hipoxantina en xantina, y después en urato. El alopurinol se convierte en oxipurinol, que inhibe irreversiblemente la xantina oxidasa (v. cap. 38) Acidificación Una H+, K+-ATPasa normalmente bombea H+ fuera de las células del parietales y hacia la luz del estómago (v. cap. 34). El omeprazol y otros estómago inhibidores de la bomba de protones relacionados forman un enlace covalente muy persistente con un residuo de cisteína de la H+, K+-ATPasa Formación de urato

ATPasa, adenosina trifosfatasa; AMPc, adenosina monofosfato cíclico; dTMP, desoxitimidina monofosfato; dUMP, desoxiuridina monofosfato; HMG-CoA, 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A; UDP, uridina difosfato.

Si una enzima está expuesta a un inhibidor competitivo, el sustrato compite con el inhibidor. Por lo tanto, una concentración elevada del sustrato puede hacer que la presencia del inhibidor sea irrelevante para la actividad enzimática. Un inhibidor competitivo incrementa la Km aparente, aunque no tiene ningún efecto sobre la Vmáx de una enzima. Por el contrario, un inhibidor competitivo reduce la Vmáx, pero no tiene ningún efecto sobre la Km. En enzimología, el adjetivo alostérico a menudo se utiliza incorrectamente como sustituto de cooperativo. En sentido estricto, un activador o inhibidor alostérico (también denominado efector alostérico) por definición se une a una enzima a cierta distancia del sitio catalítico. La mayor parte de las enzimas sometidas a regulación alostérica también son complejos multiméricos de varias subunidades idénticas, y muestran cooperatividad (v. sección 3). Sin embargo, esto no significa que todas las enzimas con regulación alostérica deban mostrar cooperatividad (la cooperatividad habitualmente significa que la conformación de una subunidad afecta a la conformación de otras subunidades en un complejo enzimático multimérico). Si una enzima acepta sustratos diferentes en el mismo sitio, cada sustrato actúa como inhibidor competitivo de los otros sustratos. Por ejemplo, la alcohol deshidrogenasa acepta etanol, etilenglicol («anticongelante») y metanol como sustratos. Por lo tanto, en los pacientes intoxicados con metanol o etilenglicol se puede utilizar etanol para reducir la formación de un producto tóxico a partir del metanol o el etilenglicol (v. cap. 36). Aunque prácticamente todos los inhibidores fisiológicos y la mayor parte de los inhibidores utilizados como fármacos actúan de forma reversible, otros actúan de forma irreversible. Entre estos inhibidores irreversibles, algunos simplemente se disocian de la enzima con una velocidad extremadamente lenta, y, por lo tanto, en la práctica son irreversibles. Los inhibidores verdaderamente irreversibles reaccionan con una enzima formando un enlace covalente que no se puede escindir con facilidad. Estos inhibidores pueden modificar cualquier porción de una enzima. En relación con el análisis de la cinética enzimática, nunca muestran una inhibición competitiva pura. Algunos de estos inhibidores irreversibles son similares a sustratos, pero después atrapan la enzima irreversiblemente en una fase de su ciclo catalítico. A estos últimos inhibidores también se les denomina inhibidores suicidas; en la tabla 10.4 se muestran tres ejemplos. Una enzima que ha reaccionado con un inhibidor suicida no puede recuperar su actividad catalítica, y debe ser

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degradada y sustituida. Los términos de uso habitual inhibición por retroalimentación (feedback), inhibición por producto y activación por proalimentación (feed-forward) se basan en el conocimiento de las rutas o vías metabólicas. Inhibición por retroalimentación se refiere a la inhibición de la actividad de una enzima por un producto en sentido distal en la vía metabólica. Inhibición por producto se refiere a la inhibición de una enzima por su producto. Algunos científicos consideran que la inhibición por producto es una forma de inhibición por retroalimentación. Otros reservan el término inhibición por retroalimentación a los inhibidores que no son el producto inmediato de la reacción en cuestión y, por lo tanto, no consideran que la inhibición por producto sea una forma de inhibición por retroalimentación. Activación por proalimentación se refiere a la activación de una enzima por un metabolito en sentido proximal, es decir, correspondiente a una reacción anterior en la vía metabólica a la catalizada por la enzima en cuestión. Los siguientes son ejemplos de inhibición por retroalimentación, inhibición por producto y activación por proalimentación en la glucólisis (v. cap. 19): el producto glucosa-6-fosfato inhibe la hexocinasa, la retroalimentación por el ATP inhibe la fosfofrutocinasa 1, y la proalimentación por fructosa-1,6-bisfosfato activa la piruvato cinasa. Algunas enzimas cambian de actividad en respuesta a su modificación covalente. Los ejemplos mejor conocidos son enzimas que pueden ser fosforiladas (adición de un grupo fosfato) en uno o más residuos fundamentales. Las cinasas añaden grupos fosfato, y las fosfatasas los eliminan. Son ejemplos la glucógeno sintasa y la glucógeno fosforilasa (v. cap. 24).

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5. Actividad enzimática y flujo en las rutas metabólicas Por comodidad, las reacciones catalizadas por enzimas se dividen en reacciones fisiológicamente reversibles e irreversibles. Las reacciones irreversibles se producen fisiológicamente solo en una dirección, independientemente de la concentración de los reaccionantes y los productos. Estas reacciones hacen que las moléculas sigan estas rutas, y la actividad de las enzimas que las catalizan a menudo está regulada por la concentración de un producto de la ruta. La carencia parcial de una enzima de una ruta metabólica puede limitar el flujo por todos los pasos de la ruta. En bioquímica clínica es útil dividir las reacciones catalizadas por enzimas en grupos de reacciones fisiológicamente reversibles e irreversibles. Todas las reacciones químicas y reacciones catalizadas por enzimas pueden avanzar solo en la dirección en la que se libera energía libre de Gibbs (v. sección 2). En teoría se pueden elegir los reaccionantes y los productos de cualquier reacción química de tal manera que la reacción se dé en un sentido o en el contrario (es decir, toda reacción química es reversible). Las enzimas también catalizan reacciones en ambas direcciones. Sin embargo, en el interior de un organismo solo un intervalo relativamente estrecho de concentraciones de reaccionantes y productos es compatible con la vida. En este texto se utilizan los términos reversible e irreversible como se señala a continuación. Las reacciones fisiológicamente reversibles a menudo están próximas al equilibrio y pueden tener lugar en un sentido o en el opuesto dependiendo de las concentraciones de los reaccionantes y los productos (estas reacciones tienen generalmente un cambio de energía libre de Gibbs, ∆G, entre 0 y aproximadamente −20 kJ/mol). Las reacciones fisiológicamente irreversibles están lejos del equilibrio y tienen lugar solo en una dirección porque la concentración de los productos en relación con la de los reaccionantes nunca es tan alta como para invertir el sentido de la reacción (estas reacciones generalmente tienen un cambio de energía libre de Gibbs, ∆G, entre aproximadamente −20 y −130 kJ/mol). En el hígado, por ejemplo, las reacciones reversibles de la glucólisis tienen lugar en una dirección en estado posprandial (v. cap. 19), y en la dirección contraria en ayunas (v. cap. 25); en ayunas las enzimas que catalizan las reacciones irreversibles de la glucólisis están bastante inactivas, y las enzimas que catalizan reacciones irreversibles diferentes para la gluconeogénesis están activas. Las reacciones irreversibles hacen que las sustancias químicas entren en las rutas, y la velocidad de estas reacciones no depende de la concentración de los productos. En la ruta que se muestra en la figura 10.5, la reacción 1 introduce irreversiblemente A en la ruta. Esta reacción habitualmente está regulada, generalmente por inhibición por un producto de una reacción posterior en la ruta (es decir, inhibición por retroalimentación; v. sección 4).

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Además, una reacción de este tipo a menudo limita también el flujo por la ruta (el flujo es el número de moléculas que pasan por unidad de tiempo). En la glucólisis, por ejemplo (v. cap. 19), A es fructosa-6-fosfato y B es fructosa1,6-bisfosfato; la reacción 1 es catalizada por la fosfofrutocinasa 1, que está regulada por las concentraciones de AMP y ATP. Puede considerarse que estos nucleótidos son reguladores por retroalimentación porque la glucólisis reduce la concentración de AMP y mantiene o incrementa la concentración de ATP.

FIG. 10.5 Regulación normal y anormal del flujo por una ruta metabólica. Las flechas unidireccionales indican reacciones irreversibles; las flechas bidireccionales indican reacciones reversibles.

En la ruta que se ha descrito más arriba (v. fig. 10.5), B se convierte en C y después en D por las reacciones reversibles 2 y 3. En condiciones normales habitualmente hay un exceso de actividad enzimática para catalizar estas reacciones. Además, la actividad de las enzimas que catalizan estas reacciones no está regulada. Las concentraciones relativas de B, C y D dependen en gran medida de la termodinámica química, y en menor medida de la velocidad del flujo a través de la ruta (a un flujo bajo, las concentraciones de B, C y D están más próximas al equilibrio que a un flujo elevado). Los ejemplos de reacciones reversibles de la glucólisis son las que se muestran con flechas bidireccionales en la figura 19.2 figura 19.2. En la ruta que se muestra en la figura 10.5, la reacción 4, que es irreversible, determina las concentraciones de los productos intermedios B, C y D. La velocidad de la reacción irreversible 4 depende solo de la concentración de D. Si la velocidad de la reacción 4 es menor que la de la reacción 1, la concentración de los productos intermedios B, C y D aumenta, lo que también incrementa la velocidad de la reacción 4. Por lo tanto, las concentraciones de B, C y D dependen de la cantidad de enzima que cataliza la reacción 4, además de las propiedades cinéticas de esta enzima. Un ejemplo de la reacción 4 en la glucólisis es la conversión de fosfoenolpiruvato en piruvato, que es catalizada por la piruvato cinasa (v. cap. 19). Algunos productos intermedios de la glucólisis son necesarios para otras rutas, por lo que el

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control de las concentraciones de estos productos intermedios es importante. De hecho, la actividad de la piruvato cinasa está controlada no solo por la cantidad de enzima que está presente y activa, sino también por un producto intermedio de la ruta, la fructosa-1,6-bisfosfato (p. ej., B en la ruta de la fig. 10.5). El estado estacionario se define como un estado en el que no se modifican las concentraciones de los reaccionantes y los productos. Se puede considerar que muchas reacciones metabólicas están muy próximas al estado estacionario. Si una ruta metabólica lineal está en estado estacionario, todas las reacciones tienen el mismo flujo. Si la ruta que se muestra en la figura 10.5 está en estado estacionario, el flujo por la reacción A→B es, por lo tanto, el mismo que por la reacción B→C, y así sucesivamente. En las células, el estado estacionario habitualmente se consigue en un plazo de segundos. Se espera que las muestras obtenidas de los pacientes (p. ej., sangre) reflejen las condiciones del estado estacionario. Si hay carencia parcial o completa de la enzima que cataliza la reacción 3 en la ruta que se muestra en la figura 10.5, aumentan las concentraciones de B y C y disminuyen las de D y E. La concentración de A no se ve afectada por que está seguida por la reacción irreversible cuya velocidad no depende de la concentración del producto B. Una vez más, el estado estacionario generalmente se alcanza en pocos segundos. Si un paciente tiene carencia de la enzima 3, la acumulación de B y C, o el agotamiento de D y E, puede tener importancia clínica.

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6. Enzimas de la sangre que tienen importancia clínica Los datos sobre la actividad de determinadas enzimas en la sangre ofrecen al médico información sobre la presencia de lesión tisular. Los tejidos normalmente pierden una pequeña fracción de sus enzimas hacia el torrente circulatorio. El daño de un tejido incrementa esta pérdida. Las mediciones de las actividades de algunas de estas enzimas en la sangre ofrecen al médico datos útiles (tabla 10.5). En la sangre estas enzimas no tienen ninguna función fisiológica. Tabla 10.5 Enzimas sanguíneas que son útiles para el diagnóstico Enzima γ-glutamil transpeptidasa Alanina aminotransferasa Aspartato aminotransferasa Fosfatasa alcalina Creatina cinasa Lactato deshidrogenasa Amilasa Lipasa

Interpretación de una actividad anómala Su elevación puede indicar lesión hepática Su elevación puede indicar lesión hepática Su elevación puede indicar lesión hepática o cardiaca Su elevación puede indicar un trastorno obstructivo hepático o un trastorno óseo* Su elevación puede indicar daño del músculo esquelético o cardiaco. Hay isoenzimas y se puede determinar su composición La elevación de la actividad total puede indicar daño de uno de muchos tejidos. Hay isozimas La elevación puede indicar obstrucción del conducto pancreático o lesión del páncreas La elevación puede indicar lesión del páncreas

* Elevada normalmente en embarazadas por pérdida por la placenta.

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7. Enzimoinmunoanálisis de adsorción El enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) permite medir una cantidad muy pequeña de un antígeno o un anticuerpo debido a la elevada sensibilidad con la que se puede medir la actividad enzimática de un conjugado enzimaanticuerpo o enzima-antígeno. Las pruebas de ELISA se realizan con una enzima unida covalentemente a un antígeno o un anticuerpo. En la forma de análisis más sencilla (fig. 10.6) se inmoviliza un antígeno sobre la superficie de un pequeño contenedor, se añade un conjugado enzima-anticuerpo y después se mide la actividad de la enzima unida (muchas veces midiendo un producto que absorbe luz o que es fluorescente). Una de estas aplicaciones es la medición de la ferritina en el suero (v. sección 7 en cap. 15). También se pueden adsorber los anticuerpos del suero de un paciente, añadir un conjugado antígeno-enzima y medir la actividad de la enzima unida. Este método actualmente se utiliza para medir los anticuerpos contra el virus de la hepatitis C o el virus de la inmunodeficiencia humana.

FIG. 10.6 Principio básico del enzimoinmunoanálisis de adsorción. El antígeno se puede unir directamente a la superficie del contenedor para el análisis o a anticuerpos con los que se ha recubierto previamente la superficie. El producto habitualmente se mide por la absorbancia de luz, la fluorescencia tras la excitación con luz o la emisión de luz (luminiscencia).

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Resumen ■ Las enzimas se pueden identificar por su nombre sistemático como oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas o ligasas; también se pueden identificar por un número de clasificación enzimática (EC) que se basa en estas categorías. Sin embargo, en la mayor parte de los casos las enzimas con importancia clínica se siguen identificando por sus nombres recomendados, que muchas veces tienen raíces históricas. ■ Las enzimas muchas veces contienen moléculas no peptídicas como coenzimas. Cuando estas coenzimas están unidas estrechamente o de forma covalente, a menudo se las llama grupos prostéticos; son ejemplos la biotina, el hemo y el ácido lipoico. ■ Las isoenzimas (isozimas) son enzimas que catalizan la misma reacción pero que difieren en su secuencia de aminoácidos. A menudo las isoenzimas también difieren en sus propiedades cinéticas; un ejemplo son las hexocinasas. ■ Las enzimas actúan como catalizadores. Una enzima acelera una reacción posible desde el punto de vista termodinámico (una reacción con ∆G negativo) reduciendo su energía de activación. Las enzimas no modifican la posición del equilibrio químico. ■ Las enzimas tienen valores óptimos de pH y temperatura. ■ La teoría de llave y cerradura es un intento antiguo, y la teoría del ajuste inducido uno más reciente, de modelar las interacciones entre enzimas y sustratos. ■ La ecuación de Michaelis-Menten es v/Vmáx = s/(s + Km). La Km es la concentración de sustrato s a la que la enzima funciona a la mitad de su velocidad máxima (es decir, s a la que v/Vmáx = 0,5). El aumento al doble de la concentración del sustrato habitualmente no incrementa al doble la actividad enzimática porque la representación gráfica de v (o v/Vmáx) en función de s no es lineal. ■ Para las enzimas que muestran cooperatividad por un sustrato se puede modificar la ecuación de Michaelis-Menten, que pasa a ser v/Vmáx = sh/(sh + S0,5h). S0,5 es la concentración del sustrato a la que la enzima funciona a la mitad de su velocidad máxima. h es el coeficiente de Hill. ■ Una unidad enzimática (U) es habitualmente la cantidad de enzima que genera producto a una velocidad de 1 µmol/min (basado en la Vmáx calculada). ■ Por definición, los sitios reguladores alostéricos están localizados en una parte de la enzima alejada del sitio catalítico (activo). Los inhibidores competitivos compiten con el sustrato por su unión al

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sitio catalítico, mientras que los inhibidores no competitivos se unen a otro lugar. Algunos fármacos son inhibidores suicidas (es decir, habitualmente se unen al sitio catalítico y después inhiben irreversiblemente la enzima). ■ El flujo en las rutas metabólicas suele estar regulado por activación por proalimentación (feed-forward), inhibición por retroalimentación (feedback) o inhibición por producto. ■ En una ruta metabólica lineal, la carencia parcial de una enzima aumenta las concentraciones de los metabolitos que preceden a la reacción alterada (excepto los metabolitos que preceden a una reacción irreversible) y reduce las concentraciones de los metabolitos que siguen a la reacción alterada. ■ Las actividades de algunas enzimas del torrente circulatorio indican el daño de un tejido específico. Estas actividades se describen como U o UI por volumen de sangre, plasma o suero. ■ Se utiliza el enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) para medir concentraciones bajas de proteínas de interés clínico. Estos análisis deben su especificidad a las interacciones antígeno-anticuerpo y su sensibilidad a una enzima unida a un antígeno o un anticuerpo que produce muchas moléculas de producto por cada molécula de proteína de interés.

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Lecturas recomendadas ■ Biomolecular Movies and Images for Teaching. Induced fit and hexokinase. . ■ BRENDA: The Comprehensive Enzyme Information System. . Esta web proporciona una lista de enzimas, junto con nombres, reacciones, parámetros cinéticos, y un listado de referencias bibliográficas. ■ Cook PF, Cleland WW. Enzyme Kinetics and Mechanism. London: Garland Science; 2007. ■ Copeland RA. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. 2nd ed. New York: Wiley-VCH; 2000. ■ Fersht A. Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding. New York: WH Freeman; 1999. ■ Jencks WP. Catalysis in Chemistry and Enzymology. New York: McGraw-Hill; 1969. ■ Koshland DE. Application of a theory of enzyme specificity to protein synthesis. Proc Natl Acad Sci USA. 1958;44:98–104. ■ Skloot R. Some called her Miss Menten. Pittmed Mag. 2000;2(4):18–21: Disponible en .

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C A P Í T U L O 11

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Membranas biológicas Sinopsis ■ Las membranas que recubren las células y sus compartimentos subcelulares están formadas por fosfolípidos, glucoesfingolípidos, colesterol y proteínas, que están incluidas en los lípidos o unidas a la superficie de la membrana. El lado extracelular de las membranas plasmáticas contiene muchos residuos de azúcares, que están unidos covalentemente a los fosfolípidos y a las proteínas de la membrana. ■ Las membranas plasmáticas y las membranas que delimitan la mayor parte de los orgánulos contienen dos capas. Los lípidos y las proteínas de cada una de las capas difunden en sentido lateral. ■ Las sustancias que son suficientemente hidrófobas (como el oxígeno y muchos fármacos utilizados actualmente y eficaces por vía oral) pueden atravesar las membranas biológicas. Sin embargo, los compuestos con carga o muy hidrófilos no difunden a través de las membranas; por el contrario, estos compuestos atraviesan las membranas solo con ayuda de proteínas de transporte. ■ Algunas proteínas de transporte facilitan el transporte pasivo de sustancias a través de las membranas; otras utilizan la energía obtenida de la hidrólisis de nucleótidos o de un gradiente electroquímico para transportar activamente compuestos a través de una membrana.

Objetivos de aprendizaje Para dominar este tema, debería ser capaz de hacer lo siguiente: ■ Describir la estructura y el contenido de una membrana biológica tipo bicapa, enumerar al menos cinco tipos de lípidos de estas membranas, describir la distribución de estos lípidos en la membrana y caracterizar los procesos que mantienen o destruyen la asimetría de los lípidos de la membrana, prestando especial atención a la fosfatidilserina. ■ Enumerar los mecanismos mediante los cuales las proteínas se pueden fijar a una membrana. ■ Explicar cómo se transportan el etanol, el O2, el CO2, el NH3, el K+, el Na+ y la glucosa a través de las membranas tipo bicapa. ■ Comparar y contrastar el mecanismo de transporte y la velocidad de transporte de los canales o poros, las proteínas transportadoras transmembranarias y las bombas; ofrecer un ejemplo de cada uno de

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ellos.

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1. Estructura y composición de las membranas Las membranas forman barreras a las sustancias hidrófilas y así compartimentan las reacciones metabólicas, la transducción de señales, las cargas eléctricas y otros fenómenos. Las membranas están formadas por una bicapa de lípidos en la que están incluidas proteínas. Los principales lípidos de membrana son diacilglicerofosfolípidos, cardiolipina, plasmalógenos, esfingomielina, gangliósidos y colesterol. Las proteínas a menudo utilizan hélices α para atravesar las membranas. Otras proteínas están ancladas a la membrana a través de un fosfolípido, un ácido graso o un grupo prenilo.

1.1. Funciones fisiológicas de las membranas El término membrana habitualmente se reserva para las bicapas lipídicas, como la membrana plasmática, las membranas nucleares y mitocondriales internas y externas, y las membranas que delimitan los lisosomas, el retículo endoplasmático liso y rugoso, los peroxisomas, las vesículas secretoras y las vesículas sinápticas. Por el contrario, las gotitas para el almacenamiento de lípidos en el interior de las células y las partículas de lipoproteínas en la sangre están delimitadas por una monocapa de fosfolípidos (así como proteínas) (v. caps. 28 y 29). Las membranas delimitan células y compartimentos subcelulares. Las membranas pueden separar la síntesis y la degradación (p. ej., en el hígado, síntesis de ácidos grasos en el citosol y degradación de ácidos grasos en las mitocondrias; v. cap. 27). Pueden delimitar zonas para la regulación o la transducción de señales (p. ej., transducción de señales de Ca2+ en el citosol, fenómeno en el que el espacio extracelular, las mitocondrias y el retículo endoplasmático tienen funciones accesorias; v. cap. 33). Pueden actuar como andamiaje para formar complejos enzimáticos (p. ej., adenilatociclasa y proteína cinasa A; v. cap. 24) y como depósito de los fosfolípidos que son necesarios para la transducción de señales (p. ej., por fosfolipasas; v. cap. 33) o para la biosíntesis (p. ej., de prostaglandinas; v. cap. 32). También pueden actuar como aislantes eléctricos entre iones y así participar en la producción de energía (v. cap. 23) o en la transducción de señales eléctricas (p. ej., en las células endocrinas pancreáticas; v. cap. 26).

1.2. Estructura de los lípidos Las membranas tipo bicapa lipídica contienen fosfolípidos, esfingolípidos, colesterol y proteínas. Se puede ver una clasificación de los fosfolípidos y esfingolípidos en la figura 11.1. Los fosfolípidos y esfingolípidos pueden contener diversos ácidos grasos. La sección 1 del capítulo 27 muestra una

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introducción a los ácidos grasos saturados, insaturados cis e insaturados trans.

FIG. 11.1 Clasificación de los fosfolípidos y esfingolípidos. El contenido de ácidos grasos de todas las moléculas que se muestran puede variar significativamente.

Los fosfolípidos siempre contienen un fosfomonoéster o un fosfodiéster (v. fig. 11.1). Entre ellos, los diacilglicerofosfolípidos son ésteres de glicerol y dos ácidos grasos. Los diacilglicerofosfolípidos más abundantes en las membranas son fosfatidilcolina (llamada popularmente lecitina), fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilinositol. El fosfatidilinositol se puede fosforilar y después hidrolizar como parte de la transmisión de señales (v. cap. 33). Los plasmalógenos también son fosfolípidos, pero contienen un éter de vinilo y un éster (v. fig. 11.1). Los plasmalógenos llevan en su nombre el prefijo plasmenil- (p. ej., plasmeniletanolamina). Es probable que los plasmalógenos actúen como antioxidantes. El éter de vinilo reacciona con los radicales de oxígeno reactivos más fácilmente que el éster de un diacilglicerofosfolípido. En consecuencia, los plasmalógenos protegen a los ácidos grasos poliinsaturados (p. ej., ácidos araquidónico y docosahexaenoico) del ataque por radicales libres. Al menos el 20% de todos los fosfolípidos del encéfalo y del músculo cardiaco y esquelético son plasmalógenos. La mayor parte de los fosfolípidos de la mielina son plasmalógenos, y sin plasmalógenos hay un profundo deterioro de la

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conducción nerviosa. Muchos trastornos de los peroxisomas reducen la biosíntesis de plasmalógenos y, en consecuencia, la función del sistema nervioso. Los diacilglicerofosfolípidos y plasmalógenos tienen grupos de cabeza similares (es decir, colina, serina, etanolamina o inositol) (fig. 11.2).

FIG. 11.2 Estructura de los grupos de la cabeza de los diacilglicerofosfolípidos y plasmalógenos.

La cardiolipina de la membrana interna de las mitocondrias es un glicerofosfolípido único porque contiene cuatro ácidos grasos (v. fig. 11.3). Cuando está reducida la función de las mitocondrias, la cardiolipina se desplaza hacia la membrana mitocondrial externa y se convierte en una señal para la apoptosis de la célula. Los anticuerpos contra la cardiolipina se encuentran en el trastorno autoinmunitario síndrome antifosfolipídico, que tiene una prevalencia de aproximadamente el 0,5% y causa trombosis vascular (formación de coágulos en el interior de los vasos sanguíneos).

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FIG. 11.3 Estructura de una cardiolipina. Diversos ácidos grasos pueden formar parte de la cardiolipina.

Uno de los sustituyentes del glicerol en los alquilacilglicerofosfolípidos es un grupo alquilo, y el otro es un grupo acilo. Por lo tanto, los alquilacilglicerofosfolípidos contienen un éter sencillo (no un éter de vinilo) y un éster. Los esfingolípidos (v. fig. 11.1) contienen un esfingoide, que se sintetiza a partir de serina y un ácido graso. Los esfingolípidos se dividen en dos categorías, fosfoesfingolípidos y glucoesfingolípidos. Los fosfoesfingolípidos son también fosfolípidos porque contienen un grupo fosfato. El fosfoesfingolípido más frecuente es la esfingomielina. Los glucoesfingolípidos se encuentran principalmente en la hoja externa de las membranas plasmáticas; los más habituales son los gangliósidos, que contienen uno o más residuos de ácido siálico (habitualmente ácido Nacetilneuramínico). Los gangliósidos son particularmente abundantes en las membranas plasmáticas de las neuronas, y su degradación está alterada en la enfermedad de Tay-Sachs. Las ceramidas están formadas por un esfingoide acetilado en el nitrógeno amídico. Las ceramidas, al contrario de la esfingomielina, no contienen

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fosfato ni grupo de cabeza. Las ceramidas participan en la transducción de señales. Las ceramidas se pueden sintetizar a partir de serina y palmitato, se pueden producir directamente a partir de esfingomielina o se pueden generar a partir de un esfingoide liberado desde los lisosomas, que degradan los esfingolípidos (esta es la denominada vía de rescate). Los lisofosfolípidos son fosfolípidos (glicerofosfolípidos o esfingolípidos) que han perdido uno de los ácidos grasos que los componen. Esto habitualmente se debe a la acción de diversas fosfolipasas, como ocurre en el tubo digestivo (v. cap. 28) o en la transducción de señales (v. cap. 33). Cuando están presentes en la membrana plasmática a una concentración suficientemente elevada, los lisofosfolípidos llevan a la lisis celular (de aquí su nombre). Las membranas también contienen colesterol (fig. 11.4). Las membranas de diferentes orgánulos difieren en la composición de sus lípidos. El colesterol se encuentra habitualmente en las membranas plasmáticas, así como en las membranas de los lisosomas y la red trans-Golgi, aunque escasea en la membrana del retículo endoplasmático.

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FIG. 11.4 Estructura del colesterol. El grupo hidroxilo es hidrófilo y está situado principalmente en la interfase acuosa de las membranas, mientras que la porción restante del colesterol es hidrófoba y se asocia preferentemente a la esfingomielina. En este modelo espacial C es gris, H blanco y O rojo. (Basado en svn.cgl.ucsf.edu/chimera/trunk/devel/RasMol/RasMol_Scripts/BILAYR1P/CHOLESTE.pdb.)

1.3. Composición y estructura de las membranas tipo bicapa La bicapa lipídica de las membranas (fig. 11.5) contiene fosfolípidos, esfingolípidos y colesterol. La bicapa lipídica está formada por dos hojas, interna y externa, cada una de las cuales es una monocapa de lípidos. Los lípidos de cada monocapa son anfipáticos; sus porciones hidrófobas se agregan para formar el núcleo hidrófobo de la membrana, y sus porciones hidrófilas (grupos fosfato y grupos de la cabeza; v. fig. 11.1) miran hacia la fase acuosa a ambos lados de la membrana. Estas membranas tipo bicapa

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también se forman espontáneamente in vitro a partir de mezclas de lípidos en agua. (Los triglicéridos no son suficientemente anfipáticos para formar membranas tipo bicapa.)

FIG. 11.5

Estructura básica de una membrana formada por una bicapa lipídica. Simulación informática de una bicapa formada por fosfatidilcolina que contiene dos ácidos grasos saturados de 14 átomos de carbono. Los grupos de la cabeza se muestran en negro, y el resto de cada una de las moléculas se muestra en gris. (Modificado de Robinson AJ, Richards WG, Thomas PJ, Hann MM. Head group and chain behavior in biological membranes: a molecular dynamics computer simulation. Biophys J. 1994;67:2345–2354.)

Las membranas tipo bicapa lipídica forman una barrera contra las sustancias hidrófilas, mientras permiten el paso de muchas sustancias lipófilas no cargadas (v. sección 2). Las proteínas de la membrana están incluidas en una o las dos capas lipídicas (v. sección 1.5). Algunas de estas proteínas contribuyen a transportar sustancias hidrófilas a través de las membranas (v. sección 2.2). Los detergentes pueden destruir las membranas porque solubilizan las proteínas y los lípidos para formar micelas mixtas. Esta es la base del efecto antimicrobiano del jabón. Se utilizan liposomas (vesículas lipídicas) como vehículos para la administración de fármacos. Los liposomas están formados por una membrana constituida por una bicapa lipídica esférica que envuelve una pequeña cantidad de líquido. Los liposomas se fabrican en el laboratorio. Son mucho menores que las células. Los liposomas cargados de fármaco tienen tendencia a acumularse en el espacio extracelular de los tejidos tumorales debido a la permeabilidad de sus capilares; ahí los liposomas actúan como vesículas de liberación lenta, ya sea en el espacio extracelular o después de su captación hacia el interior de las células. Los macrófagos tienden a captar la mayor parte de los liposomas. El recubrimiento de los liposomas con polietilenglicol (PEG) prolonga mucho el tiempo durante el cual circulan. En las membranas biológicas, a la temperatura fisiológica, los fosfolípidos y

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los esfingolípidos pueden difundir libremente por la hoja en la que están, aunque no pueden translocarse fácilmente de una hoja a la otra. Las proteínas que están incluidas en la membrana (v. sección 1.5) también pueden difundir en el plano de la membrana tipo bicapa, aunque no pueden translocarse de un lado de la membrana al otro. Este estado en el que el eje longitudinal de los fosfolípidos siempre mira en la misma dirección, aunque las moléculas se pueden mover lateralmente, también se denomina estado cristalino líquido. Por el contrario, a una temperatura mucho menor, los lípidos entran en un estado de gel en el que los lípidos y las proteínas de la membrana tienen una movilidad lateral muy reducida. Los ácidos grasos insaturados incrementan la fluidez de la membrana (es decir, favorecen un estado cristalino líquido). Por el contrario, los ácidos grasos saturados reducen la fluidez de la membrana. En condiciones fisiológicas, el colesterol incrementa la resistencia mecánica de las membranas y reduce su permeabilidad al agua y a las moléculas pequeñas. El colesterol se une con más fuerza a los fosfolípidos con cadenas acilo saturadas, que se encuentran predominantemente en la esfingomielina y en menor medida en la fosfatidilcolina. En circunstancias fisiológicas el colesterol tiene el efecto de ordenar los lípidos y condensar la bicapa, lo que incrementa la resistencia y reduce la permeabilidad. Los ácidos grasos que se encuentran habitualmente en los fosfolípidos incluyen los ácidos palmítico (16:0; la nomenclatura se puede ver en la sección 1 de cap. 27), esteárico (18:0), oleico (18:1), linoleico (18:2), araquidónico (20:4) y docosahexaenoico (22:4). En una misma membrana, la fosfatidilcolina, la fosfatidilserina, la fosfatidiletanolamina y la esfingomielina a menudo difieren de manera evidente en su composición de ácidos grasos. Las dos hojas de las membranas plasmáticas tienen una composición de lípidos diferente. Entre los esfingolípidos, la esfingomielina y la fosfatidilcolina predominan en la hoja externa, mientras que la fosfatidilserina y la fosfatidiletanolamina se encuentran sobre todo en la hoja interna (la tabla 11.1 muestra un ejemplo). Tabla 11.1 Distribución asimétrica de los fosfolípidos en las membranas de los eritrocitos humanos Fosfolípido Esfingomielina Fosfatidilcolina Fosfatidilserina Fosfatidiletanolamina Otros

% del total Capa interna 2 7 13 23 3

Capa externa 20 20 2 7 3

Datos de Zachowski A. Phospholipids in animal eukaryotic membranes: transverse asymmetry and movement. Biochem J. 1993;294:1-14.

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La distribución del colesterol entre las dos hojas de la membrana es aproximadamente igual o está sesgada a favor de la hoja externa, rica en esfingomielina. Sin embargo, el colesterol también se transloca espontáneamente entre las hojas de la membrana. Las membranas plasmáticas contienen números aproximadamente iguales de moléculas de colesterol y fosfolípidos. Cuando la fosfatidilserina se mueve de la hoja interna a la hoja externa de la membrana plasmática, actúa como señal. Los macrófagos del sistema reticuloendotelial del bazo, por ejemplo, reconocen la fosfatidilserina en la superficie de los eritrocitos senescentes y los retiran de la circulación. En otras partes del cuerpo los macrófagos también reconocen el aumento de la concentración de fosfatidilserina en la hoja externa de la membrana de las células que sufren apoptosis (muerte celular programada; v. cap. 8). En las plaquetas, un aumento en la concentración de fosfatidilserina en la hoja externa de la membrana interviene en la activación de las plaquetas, un prerrequisito para la coagulación sanguínea. Las membranas biológicas contienen balsas de membrana. Hay dos tipos de balsas: 1) balsas planares, de vida corta, y 2) cavéolas, de vida prolongada. Se cree que las balsas planares están formadas principalmente por fosfolípidos y esfingolípidos saturados, colesterol y proteínas de membrana que tienen un anclaje al glucofosfatidilinositol (y miran hacia el espacio extracelular) o un anclaje a un ácido graso (y miran hacia el citosol; v. sección 1.5). Estas balsas planares son la mayor parte de las veces muy pequeñas (diámetro